發(fā)布時(shí)間：2020-08-20 14:09

【摘要】：瞬時(shí)受體電位香草酸2型受體通道(TRPV2)是一種在外周和中樞神經(jīng)系統(tǒng)廣泛分布的非選擇性陽(yáng)離子通道。TRPV2被高于52℃的傷害性高溫、滲透壓、機(jī)械力和化學(xué)刺激等激活。TRPV2在包括褐色脂肪在內(nèi)的很多組織中高表達(dá),與糖尿病、胰腺炎等疾病有關(guān)。然而,由于缺乏特異性的調(diào)節(jié)劑,對(duì)TRPV2通道的生理和藥理學(xué)功能研究甚少。研究表明,哺乳動(dòng)物體內(nèi)脂肪主要分為褐色脂肪(BAT)和白色脂肪(WAT),其中成熟褐色脂肪組織中含有許多線(xiàn)粒體,線(xiàn)粒體中的解偶聯(lián)蛋白1(UCP1)可以使電子傳遞解偶聯(lián)產(chǎn)熱,從而產(chǎn)生非顫抖性產(chǎn)熱。近期的研究發(fā)現(xiàn),TRPV2通道在褐色脂肪的分化與產(chǎn)熱作用中起重要作用。然而,由于缺乏特異性的TRPV2調(diào)節(jié)劑,TRPV2在褐色脂肪中的作用所知甚少。因此,尋找特異性調(diào)節(jié)TRPV2的小分子工具用于TRPV2通道的藥理學(xué)功能研究具有重要意義。研究目的:篩選與鑒別TRPV2特異性抑制劑,評(píng)價(jià)其對(duì)外源性及內(nèi)源性表達(dá)的TRPV2的作用,并確定抑制劑與TRPV2的結(jié)合位點(diǎn),為探討TRPV2通道的功能及相關(guān)研究提供藥理學(xué)工具。研究方法:采用鈣熒光成像Flexstation 3手段,在過(guò)表達(dá)TRPV2的HEK293細(xì)胞中對(duì)從九里香植物中分離提取的單體天然產(chǎn)物進(jìn)行了初步篩選;利用全細(xì)胞膜片鉗電生理方法記錄表達(dá)的TRPV2電流,對(duì)B304-1和B304-2進(jìn)行劑量依賴(lài)性和選擇性的評(píng)價(jià);利用PCR、RT-PCR、Western blot、電生理等技術(shù)測(cè)定TRPV2在褐色脂肪細(xì)胞中的表達(dá)量,以及B304-1和B304-2對(duì)褐色脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性TRPV2的作用;利用分子對(duì)接和點(diǎn)突變確定B304-1和B304-2與TRPV2通道的結(jié)合位點(diǎn)。研究結(jié)果:用鈣成像實(shí)驗(yàn),Flexstation 3實(shí)驗(yàn)確定B304-1和B304-2抑制TRPV2通道,電生理實(shí)驗(yàn)說(shuō)明B304-1和B304-2均可以特異性和劑量依賴(lài)性的抑制TRPV2通道,B304-1的IC_(50)為34.2±7.8μM,B304-2的IC_(50)為3.7±0.7μM;TRPV2在褐色脂肪細(xì)胞中高表達(dá),并且分化后的褐色脂肪中TRPV2表達(dá)量要明顯的高于分化前褐色脂肪細(xì)胞;B304-1和B304-2可以抑制褐色脂肪細(xì)胞中的內(nèi)源性TRPV2通道并逆轉(zhuǎn)TRPV2激動(dòng)劑引起的褐色脂肪細(xì)胞分化抑制;最后利用分子對(duì)接和點(diǎn)突變發(fā)現(xiàn)B304-1和B304-2通過(guò)與TRPV2通道高門(mén)區(qū)域結(jié)合從而抑制TRPV2通道,與B304-2形成范德華力以及與B304-1形成氫鍵的600位異亮氨酸(I600)為關(guān)鍵氨基酸。本研究中,我們發(fā)現(xiàn)了一對(duì)從九里香根部分離提取的天然香豆素對(duì)應(yīng)異構(gòu)體(-)-murraxocin(B304-1)和(+)-murraxocin(B304-2),兩者均可以特異性抑制過(guò)表達(dá)TRPV2的HEK293細(xì)胞中外源性TRPV2以及褐色脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性TRPV2電流。對(duì)應(yīng)異構(gòu)體B304-1和B304-2的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步闡明TRPV2通道功能提供了工具和化學(xué)線(xiàn)索,并且藥理學(xué)方法調(diào)節(jié)褐色脂肪細(xì)胞中的TRPV2通道可能為治療能量失衡或代謝疾病提供一種新的治療策略。研究結(jié)論:1.在過(guò)表達(dá)TRPV2的HEK293細(xì)胞中,異構(gòu)體B304-1和B304-2是TRPV2抑制劑,并且具有較好的劑量依賴(lài)性和選擇性。2.TRPV2在褐色脂肪細(xì)胞中表達(dá),并且在分化后的褐色脂肪細(xì)胞中表達(dá)更高,說(shuō)明TRPV2在BAT分化與產(chǎn)熱中發(fā)揮重要作用。3.B304-1和B304-2可以抑制分化后小鼠褐色脂肪細(xì)胞中內(nèi)源性的TRPV2,B304-1和B304-2可逆轉(zhuǎn)由TRPV2激動(dòng)劑誘導(dǎo)的褐色脂肪細(xì)胞分化抑制,提示B304-1和B304-2可能成為BAT分化與產(chǎn)熱功能研究的藥理學(xué)工具。4.B304-1和B304-2與TRPV2的結(jié)合區(qū)域?yàn)檫x擇性濾器部位,指出了可能的結(jié)合口袋,為合成效果更好、選擇性更高的TRPV2抑制劑提供了先導(dǎo)化合物。
【學(xué)位授予單位】：青島大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5

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本文編號(hào)：2798070