【摘要】：目的探討菊花中六種黃酮類單體對(duì)H2O2誘導(dǎo)的人ARPE-19細(xì)胞損傷的干預(yù)作用及金合歡素減輕H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞損傷的機(jī)制,在動(dòng)物實(shí)驗(yàn)層面驗(yàn)證金合歡素減輕碘酸鈉誘導(dǎo)的大鼠視網(wǎng)膜損傷的作用。方法體外培養(yǎng)人視網(wǎng)膜ARPE-19細(xì)胞,MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)六種黃酮類單體(金合歡素、槲皮素、芹菜素、木犀草素、香葉木素、黃芩素)對(duì)ARPE-19細(xì)胞的增殖作用及對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡的影響,FRAP法檢測(cè)六種黃酮類單體的總抗氧化能力,流式細(xì)胞儀檢測(cè)金合歡素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的超氧化物歧化酶(SOD)、活性氧(ROS)、細(xì)胞凋亡的影響,QPCR檢測(cè)金合歡素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡通路相關(guān)因子mRNA表達(dá),Western Blot檢測(cè)金合歡素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞凋亡通路相關(guān)因子蛋白的表達(dá)。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)建立碘酸鈉誘導(dǎo)的大鼠急性視網(wǎng)膜損傷模型。將SD大鼠隨機(jī)分為5組:正常組、鹽水組、模型組、金合歡素0.2um/ml組、金合歡素0.4um/ml組。在造模前3天經(jīng)玻璃體腔穿刺給藥右眼分別注入對(duì)應(yīng)濃度的金合歡素和0.9%生理鹽水。3天后造模,鹽水組、模型組、金合歡素0.2um/ml組、金合歡素0.4um/ml組大鼠經(jīng)舌下靜脈注射40mg/ml碘酸鈉(NaIO3)1ml。7天后處死大鼠,收集右眼組織標(biāo)本。運(yùn)用RPE鋪片、HE染色、TUNEL染色檢測(cè)視網(wǎng)膜組織的改變。結(jié)果MTT實(shí)驗(yàn)檢測(cè)發(fā)現(xiàn)六種黃酮類單體對(duì)人ARPE-19細(xì)胞均有促進(jìn)增殖作用;金合歡素、槲皮素、木犀草素對(duì)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞有抗凋亡作用,槲皮素與金合歡素聯(lián)合使用可以增強(qiáng)抗凋亡作用�？偪寡趸芰�:槲皮素、黃芩素、木犀草素組高于對(duì)照組,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SOD活力:單體組SOD活力高于對(duì)照組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同濃度的金合歡素作用后,SOD活力隨著劑量的增高而降低。ROS水平:槲皮素、黃芩素、木犀草素、金合歡素、芹菜素組高于對(duì)照組(P0.05),差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義;不同濃度的金合歡素作用后,ROS的產(chǎn)量隨著劑量的增高而降低。流式細(xì)胞儀檢測(cè)金合歡素處理H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞后,細(xì)胞凋亡減少,在1uM濃度時(shí)細(xì)胞凋亡最少。QPCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)金合歡素處理后cleaved caspase-3、PEDF、VEGF表達(dá)下降,Nrf2表達(dá)呈劑量依賴性增加。Western Blot檢測(cè)發(fā)現(xiàn)金合歡素處理后BAX表達(dá)下降,Bcl-2、Bcl-2/BAX比值、caspase9、Nrf2呈劑量依賴性增加。RPE鋪片發(fā)現(xiàn)模型組、鹽水組、金合歡素組出現(xiàn)細(xì)胞核凋亡、融合,結(jié)構(gòu)紊亂,細(xì)胞間隙增大,金合歡素組核溶解較小。HE染色發(fā)現(xiàn)模型組、鹽水組、金合歡素組結(jié)構(gòu)紊亂,外核層、內(nèi)核層胞核排列不規(guī)則,模型組與金合歡素組相比改變明顯,金合歡素組胞核排列較整齊。TUNEL染色后,發(fā)現(xiàn)鹽水組、模型組凋亡細(xì)胞數(shù)明顯增多,金合歡素組與模型組相比進(jìn)一步減少。結(jié)論1.金合歡素、槲皮素、香葉木素、木犀草素、芹菜素、黃芩素有抗氧化作用,金合歡素、槲皮素、木犀草素有抗凋亡作用,這六種單體可以保護(hù)H2O2誘導(dǎo)的ARPE-19細(xì)胞的氧化損傷,其中金合歡素的作用最強(qiáng)。2.金合歡素可以減輕H2O2刺激ARPE-19細(xì)胞引起的氧化應(yīng)激反應(yīng),修復(fù)氧化應(yīng)激受損的ARPE-19細(xì)胞,減少H2O2刺激ARPE-19細(xì)胞引起的細(xì)胞凋亡,抑制ARPE-19細(xì)胞凋亡通路相關(guān)因子的表達(dá),維持了細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。金合歡素通過(guò)抗氧化、抗凋亡作用保護(hù)H2O2刺激ARPE-19細(xì)胞引起的氧化損傷。3.金合歡素作為抗氧化劑可以抑制血管生長(zhǎng)因子的分泌。4.金合歡素減輕NaIO3誘導(dǎo)的RPE細(xì)胞壞死,減少RPE凋亡,對(duì)急性視網(wǎng)膜損傷后的形態(tài)學(xué)改變有明顯的保護(hù)作用。
【學(xué)位授予單位】：中國(guó)中醫(yī)科學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

胞用ＰＢＳ重懸；按照ＦＩＴＣ熒光檢測(cè)條件檢測(cè)。逡逑２．邐１２統(tǒng)計(jì)學(xué)處理逡逑采用ＳＰＳＳ邋２１．０和ＧｒａｐｈＰａｄ邋Ｐｒｉｓｍ邋７．０邋Ｓｏｆｔｗａｒｅ統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，逡逑計(jì)量資料以均數(shù)土標(biāo)準(zhǔn)差（ｘ土ｓｒ表示，組間比較單因素方差分析，兩組間比較逡逑采用獨(dú)立樣本ｔ檢驗(yàn)，ｐ＜０．邋０５為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。逡逑３．結(jié)果逡逑３．邋１邋Ｈ２０２對(duì)ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞孵育２４小時(shí)后，分別加入不同濃度的ＨＡ．（終濃度為６００，邋７００，逡逑８００，９００，邋１０００，邋１１００，邋１２００，１３００，１４００ｕＭ）邋１００ｕｌ，刺激邋ＡＲＰＥ－１９邋細(xì)胞，２４ｈ逡逑后加入ＭＴＴ檢測(cè)細(xì)胞存活率。結(jié)果顯示，不同濃度的ＨＡ與正常組相比，ｐ＜０．邋０５，逡逑結(jié)果均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；在ｌ000ｕｍ濃度時(shí)，細(xì)胞凋亡率達(dá)到５０％左右，因此，下逡逑面我們選用ｌ000ｕｍ濃度作為造模濃度。逡逑１４０－

六種黃酮類單體、金合歡素聯(lián)合其他五種單體對(duì)人ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)逡逑結(jié)果，＊［）〈０？邋０５，＊＊Ｐ＜０．邋０１，＊＊＊Ｐ＜０．邋００１，＊＊＊＊Ｐ＜０．０００１邋（下同）逡逑３．邋３六種黃酮類單體對(duì)ＨＡ刺激的ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞抗凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)果逡逑以ｌＯＯＯｕｍ濃度的ＨＡ刺激ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞２４ｈ后，分別加入不同劑量金合歡逡逑素、槲皮素、香葉木素、木犀草素、芹菜素、黃芩素（終濃度為０．００１，０．０１，逡逑０．１，１，１０，１００，邋２００ｕＭ）刺激ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞，２４ｈ后加入ＭＴＴ檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。逡逑結(jié)果顯示六種單體刺激ＡＲＩＶ－１９細(xì)胞后，細(xì)胞存活率呈劑量依賴性／丨？高，在ｌｕＭ逡逑濃度時(shí)達(dá)到最高峰，之后隨劑量升高而下降，說(shuō)明在ｌｕｍ濃度時(shí)單體抗凋亡作用逡逑最強(qiáng)。逡逑再次鋪板，以ｌＯＯＯｕｍ濃度的ＨＡ刺激ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞２４ｈ后，比較六種單體逡逑ｌｕＭ濃度時(shí)的細(xì)胞存活率，比較金合歡素與其他五種單體聯(lián)合使用時(shí)細(xì)胞存活逡逑率，結(jié)果顯示；與模型組相比，金合歡素、槲皮素、木犀草素抗凋亡作用較強(qiáng)（Ｐ逡逑

邋ＨＡ造模后，六種黃酮類單體不同劑量組對(duì)人ＡＲＰＥ－１９細(xì)胞抗凋亡實(shí)驗(yàn)結(jié)逡逑果，Ａ：香葉木素Ｂ：芹菜素Ｃ：木犀草素Ｄ：金合歡素Ｅ：黃芩素Ｆ：槲皮素，＊Ｐ＜０．邋０５，逡逑＊＊Ｐ＜０．０１，邋＊＊＊Ｐ＜０．００１，＊＊＊＊Ｐ〈０．０００１邋（下同）逡逑３４逡逑

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本文編號(hào)：2797405