【摘要】：宮頸癌是女性最常見(jiàn)的生殖道惡性腫瘤之一。由于種種生物因素和行為因素,使得宮頸癌患病率居高不下。目前,宮頸癌的治療主要包括手術(shù)切除、化學(xué)藥物治療和放射治療。其中,手術(shù)切除是最直接有效的治療手段,但是只適用于沒(méi)有生育需求、且癌細(xì)胞沒(méi)有擴(kuò)散的患者。放療和化療是重要的輔助治療手段,但是給病人帶來(lái)的副作用也十分可怕,導(dǎo)致部分病人因此放棄腫瘤治療。因此尋找低毒、高效抗腫瘤藥物的任務(wù)刻不容緩。崗田酸,因其能夠有效地選擇和抑制磷酸蛋白酶PP1和PP2A,常被用作研究細(xì)胞信號(hào)通路的有力工具。許多研究表明,崗田酸能夠有效抑制某些腫瘤細(xì)胞體外增殖,并誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡。本文選擇海洋藻毒素崗田酸,研究其對(duì)HeLa細(xì)胞增殖、細(xì)胞形態(tài)和細(xì)胞周期的影響;探究其對(duì)HeLa細(xì)胞凋亡的影響及其機(jī)制,包括細(xì)胞核形態(tài)及DNA、活性氧、線粒體去極化、細(xì)胞凋亡和線粒體途徑相關(guān)酶、蛋白的表達(dá),以期為宮頸癌的治療和崗田酸的利用提供新的理論依據(jù)。結(jié)果顯示:崗田酸可以在0-120ng/ml濃度范圍內(nèi)抑制HeLa細(xì)胞的增殖,抑制率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)和劑量的增加而增加;臺(tái)盼藍(lán)拒染和倒置相差顯微鏡的觀察結(jié)果顯示,與未加藥組相比,隨著藥物濃度的增加,活細(xì)胞數(shù)目逐漸減少,細(xì)胞形態(tài)逐漸趨于圓形。借助流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期的結(jié)果發(fā)現(xiàn),經(jīng)崗田酸處理48h后,隨著藥物濃度的增加,G0/G1期細(xì)胞所占比例隨藥物濃度的增加而減少,由53.92%降低至40.80%;S期所占比例基本不變;G2/M期細(xì)胞所占比例增加,由16.39%增長(zhǎng)至37.61%,說(shuō)明崗田酸將HeLa細(xì)胞阻滯于G2/M期。Hoechst33258染色檢測(cè)細(xì)胞核形態(tài)變化的結(jié)果顯示,對(duì)照組細(xì)胞輪廓清晰,保持接觸,細(xì)胞核形態(tài)清晰,細(xì)胞完整;加藥處理后,細(xì)胞核發(fā)生邊緣化并沿細(xì)胞膜分布,部分呈現(xiàn)月牙狀,出現(xiàn)凋亡小體。瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,加藥組中出現(xiàn)梯形條狀片段;且隨著藥物濃度的增加,條帶強(qiáng)度與條帶數(shù)均增加,表明崗田酸處理HeLa細(xì)胞后,DNA會(huì)發(fā)生片段化。熒光分光光度法檢測(cè)ROS和線粒體膜電位變化,ROS檢測(cè)結(jié)果顯示,藥物處理后,細(xì)胞內(nèi)ROS含量顯著上升,表明崗田酸能夠引起HeLa細(xì)胞氧化應(yīng)激的發(fā)生;線粒體膜電位檢測(cè)結(jié)果顯示,線粒體去極化嚴(yán)重,表明崗田酸能夠降低線粒體膜電位。Annexin-V FITC/PI雙染法檢測(cè)細(xì)胞凋亡率的結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,崗田酸處理細(xì)胞后,凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加,在50ng/ml和100ng/ml時(shí)凋亡率達(dá)到56.97%和82.16%,與對(duì)照組相比具有顯著性差異。該結(jié)果表明,崗田酸能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的發(fā)生。熒光分光光度發(fā)檢測(cè)Caspase-3和Caspase-9酶活性結(jié)果顯示,與對(duì)照組相比,崗田酸處理組細(xì)胞Caspase-3、9酶活性隨著藥物濃度的增加而增加。表明藥物處理會(huì)激活Caspase-3、9酶的活性,從而引起由Caspase-3、9介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡發(fā)生。Western Blot檢測(cè)線粒體途徑相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2、Bid和Caspase-3 Western Blot檢測(cè)結(jié)果表明,促凋亡蛋白Bax、Bid和Caspase-3呈上升趨勢(shì)、抗凋亡蛋白Bcl-2呈下降趨勢(shì)。該結(jié)果說(shuō)明,崗田酸作用于HeLa細(xì)胞后,能夠通過(guò)依賴于Caspase的線粒體途徑誘導(dǎo)凋亡的發(fā)生。以上結(jié)果表明,崗田酸作用于HeLa細(xì)胞后,能夠抑制細(xì)胞增殖,將細(xì)胞周期阻滯于G2/M期;崗田酸能夠誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡,可能是通過(guò)線粒體途徑介導(dǎo)凋亡的發(fā)生。
【學(xué)位授予單位】：曲阜師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 4-2 崗田酸作用于 HeLa 細(xì)胞后細(xì)胞數(shù)量的變化（n=3）Fig 4-2 The number of HeLa cells under Okadaic acid同一時(shí)間與對(duì)照組相比，*P<0.05，**P<0.01示，崗田酸作用于 HeLa 細(xì)胞 48h 后，與對(duì)照組相比，/ml 降低至 19 萬(wàn)/ml；死細(xì)胞數(shù)目呈增加趨勢(shì)，由 21 萬(wàn)活細(xì)胞數(shù)目和死細(xì)胞數(shù)目與對(duì)照組相比，均具有極顯著l 和 100ng/ml 的崗田酸作用于 HeLa 細(xì)胞后可以有效抑微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)0 10 50 100050100Cellnum******Concentration of OA (ng/ml)

第四部分 實(shí)驗(yàn)結(jié)果 中圖 A 所示，不同濃度崗田酸處理 HeLa 細(xì)胞 48h 后，隨著崗田酸濃度的增加，例減少，由 53.92%降至 40.80%；S 期所占比例基本不變；G2/M 期比例增加，加至 37.61%。由圖 4-4 中圖 B 可知，50ng/ml 和 100ng/ml 崗田酸作用于 HeLa對(duì)照組相比，G2/M 期比例均具有極顯著性差異。10ng/ml 崗田酸作用于 HeLa0/G1 期的變化具有顯著性差異，50ng/ml 和 100ng/ml 崗田酸作用于 HeLa 細(xì)胞 期的變化具有極顯著性差異。說(shuō)明，崗田酸將 HeLa 細(xì)胞周期阻滯于 G2/M 期。亡途徑實(shí)驗(yàn)結(jié)果hst33258 染色

圖 4-6 瓊脂糖凝膠電泳觀察崗田酸對(duì) HeLa 細(xì)胞 DNA 的影響ts of Okadaic acid on HeLa cells through observation by agarose gel el往右條帶依次為：Marker、對(duì)照組、10ng/ml 、50ng/ml、100ng/，對(duì)照組細(xì)胞的 DNA 條帶為單一、明亮的條帶片段，無(wú) DNA 發(fā)生片段化，條帶呈梯狀，高藥物濃度組條帶亮度變化5000100001500020000***Flourescenceintensity

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本文編號(hào)：2795514