【摘要】：宮頸癌是女性最常見的生殖道惡性腫瘤之一。由于種種生物因素和行為因素,使得宮頸癌患病率居高不下。目前,宮頸癌的治療主要包括手術切除、化學藥物治療和放射治療。其中,手術切除是最直接有效的治療手段,但是只適用于沒有生育需求、且癌細胞沒有擴散的患者。放療和化療是重要的輔助治療手段,但是給病人帶來的副作用也十分可怕,導致部分病人因此放棄腫瘤治療。因此尋找低毒、高效抗腫瘤藥物的任務刻不容緩。崗田酸,因其能夠有效地選擇和抑制磷酸蛋白酶PP1和PP2A,常被用作研究細胞信號通路的有力工具。許多研究表明,崗田酸能夠有效抑制某些腫瘤細胞體外增殖,并誘導腫瘤細胞凋亡。本文選擇海洋藻毒素崗田酸,研究其對HeLa細胞增殖、細胞形態(tài)和細胞周期的影響;探究其對HeLa細胞凋亡的影響及其機制,包括細胞核形態(tài)及DNA、活性氧、線粒體去極化、細胞凋亡和線粒體途徑相關酶、蛋白的表達,以期為宮頸癌的治療和崗田酸的利用提供新的理論依據(jù)。結果顯示:崗田酸可以在0-120ng/ml濃度范圍內(nèi)抑制HeLa細胞的增殖,抑制率隨著時間的延長和劑量的增加而增加;臺盼藍拒染和倒置相差顯微鏡的觀察結果顯示,與未加藥組相比,隨著藥物濃度的增加,活細胞數(shù)目逐漸減少,細胞形態(tài)逐漸趨于圓形。借助流式細胞儀檢測細胞周期的結果發(fā)現(xiàn),經(jīng)崗田酸處理48h后,隨著藥物濃度的增加,G0/G1期細胞所占比例隨藥物濃度的增加而減少,由53.92%降低至40.80%;S期所占比例基本不變;G2/M期細胞所占比例增加,由16.39%增長至37.61%,說明崗田酸將HeLa細胞阻滯于G2/M期。Hoechst33258染色檢測細胞核形態(tài)變化的結果顯示,對照組細胞輪廓清晰,保持接觸,細胞核形態(tài)清晰,細胞完整;加藥處理后,細胞核發(fā)生邊緣化并沿細胞膜分布,部分呈現(xiàn)月牙狀,出現(xiàn)凋亡小體。瓊脂糖凝膠電泳結果顯示,與對照組相比,加藥組中出現(xiàn)梯形條狀片段;且隨著藥物濃度的增加,條帶強度與條帶數(shù)均增加,表明崗田酸處理HeLa細胞后,DNA會發(fā)生片段化。熒光分光光度法檢測ROS和線粒體膜電位變化,ROS檢測結果顯示,藥物處理后,細胞內(nèi)ROS含量顯著上升,表明崗田酸能夠引起HeLa細胞氧化應激的發(fā)生;線粒體膜電位檢測結果顯示,線粒體去極化嚴重,表明崗田酸能夠降低線粒體膜電位。Annexin-V FITC/PI雙染法檢測細胞凋亡率的結果顯示,與對照組相比,崗田酸處理細胞后,凋亡率隨著藥物濃度的增加而增加,在50ng/ml和100ng/ml時凋亡率達到56.97%和82.16%,與對照組相比具有顯著性差異。該結果表明,崗田酸能夠誘導HeLa細胞凋亡的發(fā)生。熒光分光光度發(fā)檢測Caspase-3和Caspase-9酶活性結果顯示,與對照組相比,崗田酸處理組細胞Caspase-3、9酶活性隨著藥物濃度的增加而增加。表明藥物處理會激活Caspase-3、9酶的活性,從而引起由Caspase-3、9介導的細胞凋亡發(fā)生。Western Blot檢測線粒體途徑相關蛋白Bax、Bcl-2、Bid和Caspase-3 Western Blot檢測結果表明,促凋亡蛋白Bax、Bid和Caspase-3呈上升趨勢、抗凋亡蛋白Bcl-2呈下降趨勢。該結果說明,崗田酸作用于HeLa細胞后,能夠通過依賴于Caspase的線粒體途徑誘導凋亡的發(fā)生。以上結果表明,崗田酸作用于HeLa細胞后,能夠抑制細胞增殖,將細胞周期阻滯于G2/M期;崗田酸能夠誘導HeLa細胞發(fā)生凋亡,可能是通過線粒體途徑介導凋亡的發(fā)生。
【學位授予單位】：曲阜師范大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 4-2 崗田酸作用于 HeLa 細胞后細胞數(shù)量的變化（n=3）Fig 4-2 The number of HeLa cells under Okadaic acid同一時間與對照組相比，*P<0.05，**P<0.01示，崗田酸作用于 HeLa 細胞 48h 后，與對照組相比，/ml 降低至 19 萬/ml；死細胞數(shù)目呈增加趨勢，由 21 萬活細胞數(shù)目和死細胞數(shù)目與對照組相比，均具有極顯著l 和 100ng/ml 的崗田酸作用于 HeLa 細胞后可以有效抑微鏡下觀察細胞形態(tài)0 10 50 100050100Cellnum******Concentration of OA (ng/ml)

第四部分 實驗結果 中圖 A 所示，不同濃度崗田酸處理 HeLa 細胞 48h 后，隨著崗田酸濃度的增加，例減少，由 53.92%降至 40.80%；S 期所占比例基本不變；G2/M 期比例增加，加至 37.61%。由圖 4-4 中圖 B 可知，50ng/ml 和 100ng/ml 崗田酸作用于 HeLa對照組相比，G2/M 期比例均具有極顯著性差異。10ng/ml 崗田酸作用于 HeLa0/G1 期的變化具有顯著性差異，50ng/ml 和 100ng/ml 崗田酸作用于 HeLa 細胞 期的變化具有極顯著性差異。說明，崗田酸將 HeLa 細胞周期阻滯于 G2/M 期。亡途徑實驗結果hst33258 染色

圖 4-6 瓊脂糖凝膠電泳觀察崗田酸對 HeLa 細胞 DNA 的影響ts of Okadaic acid on HeLa cells through observation by agarose gel el往右條帶依次為：Marker、對照組、10ng/ml 、50ng/ml、100ng/，對照組細胞的 DNA 條帶為單一、明亮的條帶片段，無 DNA 發(fā)生片段化，條帶呈梯狀，高藥物濃度組條帶亮度變化5000100001500020000***Flourescenceintensity

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本文編號：2795514