【摘要】：目的本研究是國家自然科學基金項目“基于微流控細胞生物芯片技術(shù)的木蝴蝶抗肝腫瘤活性物質(zhì)發(fā)現(xiàn)方法研究”(項目編號:81874342)的一部分。本課題在實驗室前期開展的木蝴蝶有效組分提取純化及其藥效篩選研究基礎(chǔ)上,采用HPLC等現(xiàn)代分析儀器和方法對木蝴蝶抗腫瘤有效組分總黃酮類進行指紋圖譜、含量測定及譜效關(guān)系研究,明確其抗肝腫瘤的藥效物質(zhì)基礎(chǔ);采用DEN誘導大鼠肝癌模型及微流控芯片技術(shù),驗證木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B的體內(nèi)、外抗肝腫瘤作用;從代謝組學、基因組學、相關(guān)基因蛋白等多角度闡釋木蝴蝶抗肝腫瘤有效組分總黃酮類抗肝腫瘤的作用機制,為中藥木蝴蝶作為抗肝腫瘤藥物的臨床應(yīng)用及其進一步開發(fā)研究提供實驗依據(jù)和理論基礎(chǔ)。方法1.采用HPLC法,開展木蝴蝶水、醇提取物的指紋圖譜研究,并對木蝴蝶苷B進行含量測定;基于木蝴蝶水、醇提取物的指紋圖譜,采用灰色關(guān)聯(lián)度分析軟件及Pearson相關(guān)性分析法,開展木蝴蝶總黃酮類成分與抗肝腫瘤作用的譜效關(guān)系研究。2.基于微流控芯片技術(shù),采用Hoechst 33342/PI染色法,以細胞凋亡/壞死率為考察指標,開展木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B對人肝癌細胞HepG2增殖作用的影響研究;以細胞相對遷移率為考察指標,開展木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B對人肝癌細胞HepG2遷移作用的影響研究。3.采用DEN化學誘導法建立大鼠肝癌模型,以臟器指數(shù)、肝臟病理切片、血清中細胞因子的含量、AFP/ALT/AST等酶含量為指標,開展木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B體內(nèi)抗肝腫瘤藥效學研究。4.采用HPLC-QTOF-MS技術(shù),并使用Agilent Mass Profiler Professional 12.6軟件結(jié)合相關(guān)數(shù)據(jù)庫,分析木蝴蝶總黃酮和木蝴蝶苷B干預后DEN肝癌大鼠血漿中代謝物的變化及可能參與的代謝通路,從代謝組學方面闡釋木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B抗肝腫瘤的作用機制。5.應(yīng)用Illumina二代測序儀及Agilent Microarray Scanner,分別進行木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B對DEN肝癌大鼠肝臟組織中轉(zhuǎn)錄組基因(mRNA)及非轉(zhuǎn)錄組基因(microRNA)表達的影響研究,尋找木蝴蝶總黃酮和木蝴蝶苷B干預后差異表達的mRNA和microRNA,并進行GO分析和代謝通路分析,從基因組學方面闡釋木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B抗肝腫瘤的作用機制。6.采用PT-PCR和Western Blot法,開展木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B對DEN肝癌大鼠肝臟組織相關(guān)分子靶點mRNA和蛋白質(zhì)表達的影響研究。結(jié)果1.建立了8個不同產(chǎn)地木蝴蝶水、醇提取物的指紋圖譜;木蝴蝶苷B含量測定結(jié)果顯示,不同產(chǎn)地木蝴蝶水提取物中木蝴蝶苷B的含量分別為13.98、12.94、20.34、16.83、15.78、15.37、18.44、15.78 mg·g~(-1),不同產(chǎn)地木蝴蝶醇提取物中木蝴蝶苷B的含量分別為17.65、26.45、30.99、27.62、23.46、22.62、30.42、24.03 mg·g~(-1);經(jīng)灰色關(guān)聯(lián)度軟件分析可知,木蝴蝶總黃酮中5種主要單體成分對肝癌細胞增殖抑制作用的關(guān)聯(lián)度順序為:木蝴蝶苷B白楊素-7-O-β-D葡萄糖酸酐木蝴蝶苷A黃芩素白楊素。Pearson相關(guān)性分析結(jié)果顯示,木蝴蝶總黃酮中5種主要單體成分對肝癌細胞增殖抑制作用的關(guān)聯(lián)度順序為:木蝴蝶苷B黃芩素木蝴蝶苷A白楊素白楊素-7-O-β-D葡萄糖酸酐。2.設(shè)計并制作了用于藥效篩選研究的微流控芯片,應(yīng)用該芯片進行的體外藥效實驗結(jié)果表明:木蝴蝶總黃酮和木蝴蝶苷B對人肝癌HepG2細胞均具有明顯的增殖抑制作用,抑制率最高分別為78.42%、76.69%。設(shè)計并制作了用于細胞遷移研究的微流控芯片,應(yīng)用該芯片進行的體外遷移實驗結(jié)果表明:木蝴蝶總黃酮、木蝴蝶苷B均具有顯著的抑制人肝癌HepG2細胞遷移的作用,相對遷移率最高分別為8.06%、8.85%。3.建立了DEN誘導大鼠肝癌模型,基于DEN大鼠肝癌模型的體內(nèi)藥效研究結(jié)果顯示,空白組大鼠肝組織表面紅潤光滑、質(zhì)地柔軟,模型組大鼠肝組織表面密布瘤狀結(jié)節(jié),個別瘤體直徑超過1 mm,木蝴蝶總黃酮和木蝴蝶苷B各組大鼠肝組織與模型組比較有不同程度的改善;木蝴蝶總黃酮和木蝴蝶苷B能不同程度的降低大鼠的脾指數(shù),提高大鼠的胸腺指數(shù);木蝴蝶總黃酮和木蝴蝶苷B能不同程度的降低大鼠血清中AFP、ALT、AST、TNF-α、IL-12的水平,能夠增加大鼠血清中IL-2的水平。4.根據(jù)HPLC-QTOF-MS結(jié)果,借助相關(guān)數(shù)據(jù)庫等分析鑒定木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B干預后大鼠血漿中內(nèi)源性代謝物的變化,結(jié)果表明,木蝴蝶總黃酮干預后大鼠血漿中共有285種代謝物發(fā)生變化,其中上調(diào)的有41種,下調(diào)的有244種,如Arachidonic acid、Prostaglandins、N-arachidonoyl L-serine等,推測木蝴蝶總黃酮對DEN肝癌大鼠體內(nèi)差異代謝物主要與色氨酸代謝、膽汁酸合成、花生四烯酸代謝、亞油酸代謝、絲氨酸代謝等途徑有關(guān);木蝴蝶苷B干預后大鼠血漿中共有201種代謝物發(fā)生變化,其中上調(diào)的有34種,下調(diào)的有167種,如Arachidonic acid、Prostaglandins、PA(16:0/18:1(11Z))、Prostaglandin E2(PGE2)等,推測木蝴蝶苷B對DEN肝癌大鼠體內(nèi)差異代謝物主要與氨基酸代謝、能量代謝、膽汁酸合成、花生四烯酸代謝、Ca離子信號通路、磷脂酶信號通路、MAPK信號通路等途徑有關(guān)。5.Illumina轉(zhuǎn)錄組測序的結(jié)果顯示,木蝴蝶總黃酮干預組大鼠與模型組大鼠比較,有1491個基因發(fā)生變化,其中739個基因上調(diào),752個基因下調(diào);將給藥后差異表達的基因進行相關(guān)通路注釋和富集分析,結(jié)果顯示木蝴蝶總黃酮干預后的差異表達基因與花生四烯酸代謝、Wnt signaling pathway、Angiogenesis pathway、PI3 kinase pathway、TCA cycle and respiratory electron transport等代謝或信號通路相關(guān)。Agilent Microarray Scanner芯片掃描結(jié)果顯示,木蝴蝶總黃酮干預后有82個microRNA(miRNA)發(fā)生變化,其中有23個miRNA上調(diào),59個miRNA下調(diào);木蝴蝶苷B干預后有89個miRNA發(fā)生變化,其中有36個miRNA上調(diào),53個miRNA下調(diào)。經(jīng)木蝴蝶總黃酮、木蝴蝶苷B共同調(diào)控的miRNA有36個,其中有29個下調(diào),7個上調(diào);差異表達miRNA可能參與MAPK signaling pathway、NF-kappa B signaling pathway、TGF-beta signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、TNF-αsignaling pathway等信號通路。5.RT-PCR和Western blot結(jié)果表明,木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B各給藥組能不同程度的降低PI3K、p38 mRNA的表達,能增加Akt、PTEN、Caspase 9、Caspase 3 mRNA的表達;木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B各給藥組能不同程度的降低PI3K、p38、p-p38、TGF-β、p-Akt蛋白質(zhì)的表達,能增加PTEN、Caspase 9、Caspase 3蛋白質(zhì)的表達。結(jié)論1.不同產(chǎn)地木蝴蝶水、醇提取物中木蝴蝶苷B含量最高的產(chǎn)地均為湖南張家界,且醇提取法得到提取物中的木蝴蝶苷B含量高于水提取法。各單體成分中與抗肝腫瘤藥效相關(guān)性最大的為木蝴蝶苷B。2.木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B具有很好的體外抑制肝癌細胞增殖和遷移的作用。3.木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B具有很好的體內(nèi)抗肝腫瘤作用,在提高肝癌患者生存質(zhì)量,延長患者生存周期上顯示出獨特的優(yōu)勢。4.木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B對DEN肝癌大鼠體內(nèi)代謝物有一定調(diào)節(jié)作用,可能與氨基酸代謝、能量代謝、膽汁酸合成、花生四烯酸代謝、Ca離子信號通路、磷脂酶信號通路、MAPK信號通路等途徑有關(guān)。5.木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B對DEN肝癌大鼠體內(nèi)轉(zhuǎn)錄組基因和非轉(zhuǎn)錄組基因均有一定的調(diào)節(jié)作用,可能與花生四烯酸代謝、Wnt signaling pathway、Angiogenesis pathway、PI3 kinase pathway、TCA cycle and respiratory electron transport、TGF-beta signaling pathway、PI3K-Akt signaling pathway、TNF-αsignaling pathway等代謝或信號通路相關(guān)。6.木蝴蝶總黃酮及木蝴蝶苷B促進腫瘤細胞凋亡、抑制腫瘤細胞增殖和轉(zhuǎn)移的作用,可能與調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路、p38 MAPK信號通路、TGF-β信號通路中相關(guān)分子靶點有關(guān)。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

密吸取 5 μL，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄 270 nm 波長色譜圖，把 8個不同產(chǎn)地的中藥木蝴蝶水提物色譜圖導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版）[12-13]，相似度均大于 0.90，RSD 為 0.66%，8 批次木蝴蝶水提取物指紋圖譜共有模式見圖 1-1-7；

2 577.5 605.5 602.3 602.3 592.3 597.1 596.2 1.723 7359.0 7464.5 7442.7 7442.0 7343.3 7327.1 7396.4 0.814 374.7 380.1 379.7 379.0 372.2 373.1 376.6 0.945 7213.5 7312.2 7280.1 7286.4 7170.1 7190.7 7242.2 0.806 5523.4 5613.7 5595.2 5604.9 5497.4 5521.4 5559.3 0.91由表1-2-6、1-2-7可知，各共有峰峰面積相對保留時間的RSD均小于0.09%，相對峰面積的 RSD 均小于 1.72%，表明該方法重復性良好。3.3 不同產(chǎn)地木蝴蝶醇提物指紋圖譜的建立取 8 個不同產(chǎn)地的木蝴蝶藥材，按“2. 1”項下方法制備供試品溶液，各精密吸取 5 μL，按“2.3”項下色譜條件進行測定，記錄 270 nm 波長色譜圖，把 8個不同產(chǎn)地的木蝴蝶醇提物色譜圖導入中藥指紋圖譜相似度評價系統(tǒng)（2012.130723 版）[14]，相似度均大于 0.90，RSD 為 0.87%，8 批次木蝴蝶藥材醇提物指紋圖譜共有模式見圖 1-2-7；

長狀態(tài)良好的細胞，經(jīng) PBS 清洗，用 0.25%的胰酶消化，用 DMEM 培養(yǎng)液制成細胞懸液。調(diào)整細胞濃度為 5×104個·mL-1，接種于 96 孔培養(yǎng)板，每孔 100 μL，繼續(xù)培養(yǎng) 24 h 待細胞貼壁完全。設(shè)加藥試驗孔、空白對照孔（加細胞，但不加藥物），每組設(shè) 5 個復孔。繼續(xù)培養(yǎng) 48 h 后，每孔避光加 20 μL（5 mg·mL-1）MTT，繼續(xù)培養(yǎng) 4 h 后吸凈孔內(nèi)上清液，每孔加入 150 μL DMSO，搖床振搖 10 min，用酶標儀在 492 nm 處掃描，測定吸光值（OD）。細胞的抑制率（%）=（1－OD試驗組/ OD對照組）×100%。3 實驗結(jié)果3.1 藥物篩選芯片根據(jù)實驗需求，本課題組設(shè)計一種藥物高通量篩選 PDMS-玻璃復合芯片---蝴蝶芯片[24-26]，結(jié)合矢量圖制圖軟件 CorelDraw 16.0 對芯片的結(jié)構(gòu)進行設(shè)計和優(yōu)化，借助超高分辨打印機以絲印的方式輸出到透明菲林片上制成掩模，結(jié)構(gòu)示意圖見圖 2-1-1。按照“2.2”項下方法制作芯片，實物圖見圖 2-1-2。

【參考文獻】

相關(guān)期刊論文 前10條

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本文編號：2794687