【摘要】：多糖是由醛糖和(或)酮糖通過糖苷鍵將單糖連接在一起的一類天然大分子聚合物,是機(jī)體生命活動必不可少的物質(zhì)。糖生物組學(xué)已經(jīng)成為繼基因組學(xué)、蛋白質(zhì)組學(xué)之后的第3個生物學(xué)里程碑。多糖具有多種重要的生物活性,特別是在調(diào)節(jié)機(jī)體免疫、增強(qiáng)細(xì)胞抗腫瘤活性等方面。目前對多糖的免疫活性成分的篩選方法是在傳統(tǒng)的提取、分離和結(jié)構(gòu)解析的基礎(chǔ)上利用藥理模型對多糖進(jìn)行免疫活性測試,但該方法比較繁瑣,且耗時較長。巨噬細(xì)胞(macrophagocyte,Mφ)是多糖發(fā)揮免疫調(diào)節(jié)作用的最主要的效應(yīng)細(xì)胞,在免疫系統(tǒng)中發(fā)揮關(guān)鍵作用。多糖對Mφ的免疫調(diào)節(jié)作用主要通過對Mφ分泌細(xì)胞因子的影響及調(diào)節(jié)Mφ激活的信號通路兩個方面進(jìn)行。黃嘌呤氧化酶(xanthine oxidase,XOD)是機(jī)體催化黃嘌呤或次黃嘌呤轉(zhuǎn)化為尿酸關(guān)鍵酶,同時XOD催化過程中生成的氧自由基影響整個免疫系統(tǒng):尿酸過多會在關(guān)節(jié)處沉積,形成炎癥,誘發(fā)機(jī)體的免疫反應(yīng);氧自由基也具有調(diào)節(jié)免疫活性、前列腺素合成、Mφ吞噬等作用。多糖可以通過對XOD的作用,發(fā)揮其免疫調(diào)節(jié)活性。本論文的研究目的是構(gòu)建復(fù)壁碳納米管修飾的Mφ脂筏免疫親和色譜系統(tǒng)以及XOD酶免疫親和色譜系統(tǒng),實(shí)現(xiàn)多糖免疫活性的在線篩選,建立起一套快速、準(zhǔn)確、使用壽命長的多糖免疫活性篩選系統(tǒng)。主要研究內(nèi)容如下:1.Mφ脂筏免疫親和色譜及XOD免疫親和色譜在線篩選模型的構(gòu)建:1)親和色譜固定相材料的制備:首先將酰化的復(fù)壁碳納米管(Carbon Nanotube Multi-walled,CNTm)與硅烷化的硅膠反應(yīng)制備復(fù)壁碳納米管包裹的硅膠(CNTm@SiO_2)。將人單核細(xì)胞(monocytes,THP-1)誘導(dǎo)分化成Mφ,采用蔗糖梯度密度溶液超速離心法,獲取脂筏;在冰浴條件下,分別向Mφ脂筏溶液、XOD溶液中加入CNTm@SiO_2,制備Mφ包裹的CNTm@SiO_2色譜固定相(Mφ@CNTm@SiO_2)及XOD包裹的CNTm@SiO_2色譜固定相(XOD@CNTm@SiO_2)。掃面電子顯微鏡表征及免疫活性檢測等結(jié)果表明:提取脂筏活性穩(wěn)定,制備成固定相后,脂筏及XOD很好的吸附于CNTm@SiO_2表面,且XOD與脂筏的免疫活性基本沒受影響。2)親和色譜系統(tǒng)的性能考察:采用低壓裝柱法制備親和色譜柱,并對其免疫親和色譜系統(tǒng)進(jìn)行考察。分別考察Mφ@CNTm@SiO_2色譜固定相及色譜系統(tǒng)、XOD@CNTm@SiO_2色譜固定相及色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性、專屬性和使用壽命。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示色譜系統(tǒng)的穩(wěn)定性和專屬性良好,連續(xù)在線使用240 h后,其色譜活性沒受影響,色譜柱活性保持良好,且使用壽命與未修飾的脂筏色譜相比大大延長。3)對不同分子量葡聚糖在這兩種色譜上的保留行為分別進(jìn)行研究,發(fā)現(xiàn)葡聚糖分子量的Ln值與其在色譜系統(tǒng)的保留時間成反比,回歸方程的線性關(guān)系良好,為后續(xù)多糖篩選和免疫活性強(qiáng)弱判斷奠定基礎(chǔ)。2.中藥多糖免疫活性在線篩選研究:選取十五味中藥材,利用有機(jī)溶劑先除色素,經(jīng)水提醇沉及除蛋白得到粗多糖,再利用大孔樹脂層析柱、離子交換層析柱和凝膠過濾層析柱對粗多糖進(jìn)一步分離純化,得到分子量相對均一的純化多糖組分17個,利用親和色譜在線活性篩選模型篩選多糖的免疫活性。1)多糖的分離純化:藥材用石油醚和無水乙醇脫色后,超純水提取濃縮后用95%乙醇沉淀多糖,沉淀物用Sevage法除蛋白質(zhì),超純水透析兩天,得到十五味中藥的粗多糖。利用AB-8、D-101和D-315型大孔吸附樹脂對粗多糖進(jìn)行脫色。最后,將脫色后的粗多糖依次用離子交換層析柱和葡聚糖凝膠層析柱進(jìn)行純化,得到分子量相對均一的純化多糖。2)多糖純度鑒定:采用紫外分光光度法測定純化多糖的純度,元素分析儀對純化多糖進(jìn)行元素含量檢測;采用高效液相色譜對多糖的純度及分子量的進(jìn)行測定。綜合分析純度檢測結(jié)果,可證實(shí)所分離純化的多糖分子量均相對均一,幾乎均不含蛋白質(zhì)、核酸、小分子化合物、色素、無機(jī)鹽等雜質(zhì),多糖的純度均較高。3)多糖含量測定:采用苯酚-硫酸法對多糖的總糖含量進(jìn)行檢測。以葡聚糖濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=8.177x-0.0414,R2=0.9976,線性范圍良好。分離純化得到的17種多糖的總多糖含量均超過98.5%。4)蛋白質(zhì)含量測定:采用考馬斯亮藍(lán)法檢測蛋白質(zhì)含量。以牛血清蛋白濃度為橫坐標(biāo),吸光度值為縱坐標(biāo),標(biāo)準(zhǔn)曲線:y=0.0299x+0.0028,R~2=0.9901,線性關(guān)系良好。分離純化得到的17種多糖的蛋白質(zhì)含量均未超過0.5%。5)純化多糖免疫活性在線篩選:分別用Mφ@CNTm@SiO_2色譜系統(tǒng)及XOD@CNTm@SiO_2色譜系統(tǒng)對多糖的免疫活性進(jìn)行在線篩選。通過與多糖在Mφ@CNTm@SiO_2免疫親和色譜柱上的理論保留時間相比較,發(fā)現(xiàn)金銀花-2多糖、川牛膝多糖、黃芩多糖、苦參多糖、當(dāng)歸多糖、金針菇多糖、白芍-1多糖在Mφ@CNTm@SiO_2免疫親和色譜柱上實(shí)際保留時間明顯延遲;通過與多糖在XOD@CNTm@SiO_2免疫親和色譜柱上的理論保留時間相比較,金銀花-2多糖、川牛膝多糖、黃芩多糖、苦參多糖、金針菇多糖、白芍-1多糖、白芍-2多糖在XOD@CNTm@SiO_2免疫親和色譜柱上的實(shí)際保留時間明顯延遲。3.中藥多糖免疫活性體內(nèi)外評價采用體內(nèi)體外結(jié)合的方法檢測多糖對XOD和Mφ活性的影響,驗(yàn)證Mφ@CNTm@SiO_2免疫親和色譜以及XOD@CNTm@SiO_2免疫親和色譜在線篩選多糖免疫活性結(jié)果的準(zhǔn)確性。1)多糖對體外培養(yǎng)的Mφ吞噬的影響:采用紫外分光光度法來考察多糖對Mφ的吞噬的情況。研究結(jié)果表明,金銀花-2多糖組、川牛膝多糖組、黃芩多糖組、苦參多糖組、金針菇多糖組、白芍-1多糖組、白芍-2多糖組均可以顯著影響Mφ的吞噬行為。2)多糖對Mφ分泌的NO和TNF-α的影響:ELISA試劑盒檢測結(jié)果表明,金銀花-2多糖組、川牛膝多糖組、黃芩多糖組、苦參多糖組、金針菇多糖組、白芍-1多糖組、白芍-2多糖組、當(dāng)歸多糖組均可以顯著提高NO、TNF-α分泌量;黃芪多糖組顯著提升Mφ分泌NO的能力。3)多糖對體內(nèi)Mφ吞噬能力影響:采用小鼠腹腔Mφ吞噬雞紅細(xì)胞試驗(yàn)測定多糖對Mφ體內(nèi)吞噬能力的影響。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,金銀花-2多糖組、川牛膝多糖組、黃芩多糖組、苦參多糖組、金針菇多糖組、白芍-1多糖組、白芍-2多糖組的小鼠Mφ吞噬能力顯著提高。4)純化多糖的體外抑制XOD活性研究:用紫外分光光度法檢測尿酸的含量,推斷多糖對XOD抑制活性。研究結(jié)果:金銀花-2多糖、川牛膝多糖、黃芩多糖、苦參多糖、金針菇多糖、白芍-1多糖、白芍-2多糖有抑制XOD的活性。5)多糖在體內(nèi)對XOD抑制活性研究:建立高尿酸癥大鼠模型,檢測純化多糖對大鼠的血清及肝臟中XOD活性的影響,研究結(jié)果表明,金銀花-2多糖組、川牛膝多糖組、黃芩多糖組、苦參多糖組、金針菇多糖組、白芍-1多糖組、白芍-2多糖組可以顯著降低血清及肝臟中XOD的活性。6)純化多糖對大鼠血尿酸水平影響:大鼠高尿酸血癥模型的建立,可以通過檢測尿酸濃度,在一定程度上反應(yīng)多糖對XOD的抑制活性。研究結(jié)果表明,金銀花-2多糖組、川牛膝多糖組、黃芩多糖組、苦參多糖組、金針菇多糖組、白芍-1多糖組、白芍-2多糖組、山藥多糖組、黃芪多糖組、白芨多糖組可明顯降低大鼠血尿酸濃度。通過以上實(shí)驗(yàn)證明建立的兩種親和色譜具有可靠的多糖免疫活性篩選能力,采用陰性對照品葡聚糖所建立的半定量分析方法準(zhǔn)確性高。4.多糖的結(jié)構(gòu)解析及構(gòu)效關(guān)系初步探討本章對分離純化的17種多糖的結(jié)構(gòu)進(jìn)行初步解析,主要采用高效液相、紅外光譜、核磁共振、高碘酸氧化、剛果紅實(shí)驗(yàn)等分析方法和分析儀器。對多糖的初級及高級結(jié)構(gòu)進(jìn)行研究,結(jié)合前期多糖的免疫活性的測定,初步探索多糖的構(gòu)效關(guān)系。1)多糖分子量與活性關(guān)系:在一定范圍內(nèi),大分子量的多糖具有更多數(shù)量的單糖,糖鍵的連接方式更多,聚合種類也更多,所以空間結(jié)構(gòu)更加復(fù)雜,有可能會提高其生物活性。2)單糖組成與活性關(guān)系:采用柱前衍生化-高效液相色譜法對多糖的單糖組分進(jìn)行檢測。研究發(fā)現(xiàn),具有葡聚糖主鏈結(jié)構(gòu),含有阿拉伯糖、半乳糖、甘露糖的多糖具有較強(qiáng)的促進(jìn)免疫活性作用;糖醛酸可以明顯增加多糖的免疫活性。3)糖苷鍵的類型與活性關(guān)系:采用高碘酸氧化多糖反應(yīng)分析糖苷鍵連接類型。研究發(fā)現(xiàn),免疫活性強(qiáng)的多糖中的1→3糖苷鍵所占比例比其他純化多糖組分的比列高。推測可能是因?yàn)?→3糖苷鍵為非還原性糖苷鍵,其比例越大,穩(wěn)定性和耐受性越高,活性所受影響越小。4)異頭碳類型與活性的關(guān)系:采用傅里葉變換-紅外光譜分析及~1H-NMR分析異頭碳類型。結(jié)果表明,異頭碳的聯(lián)合類型與多糖免疫活性大小的關(guān)系不明顯。5)多糖高級結(jié)構(gòu)與活性的關(guān)系:采用剛果紅實(shí)驗(yàn)以及透射電鏡分析多糖的高級構(gòu)象。研究表明,具有三螺旋空間構(gòu)象的多糖其免疫活性相應(yīng)較強(qiáng),而透射電鏡的分析結(jié)果也證明這幾個純化多糖具有類似蠕蟲鏈狀的空間構(gòu)象,與其三螺旋空間構(gòu)象類似。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：O657.7;R284
【圖文】：

圖 2.1 硅膠及 CNTm@SiO2SEM 圖Fig 2.1 SEM images of silica gel and CNTm@SiO2 脂筏的表征圖 2.2 所示，由脂筏的免疫組化結(jié)果可得，Mφ脂筏特異性的熒光（表明該方法制備的脂筏具有免疫活性。圖 2.2 脂筏熒光倒置顯微鏡圖觀察 Mφ脂筏特異性的熒光（CD80）Fig 2.2 fluorescence inverted microscope images of lipid rafts

圖 2.1 硅膠及 CNTm@SiO2SEM 圖Fig 2.1 SEM images of silica gel and CNTm@SiO23.2 M 脂筏的表征如圖 2.2 所示，由脂筏的免疫組化結(jié)果可得，Mφ脂筏特異性的熒光（CD80）顯著，表明該方法制備的脂筏具有免疫活性。

圖 2.4：SiO2、CNTm@SiO2、Mφ@CNTm@SiO2的激光共聚焦圖Fig 2.4 Confocal images of SiO2、CNTm@SiO2、Mφ@CNTm@SiO23.5 XOD 與 XOD@CNTm@SiO2酶活性評價按照本章“2.7 項(xiàng)”進(jìn)行尿酸體外標(biāo)曲的建立：得到其線性回歸方程為：A=749675C+53354，R2=0.999，按本章“2.7 項(xiàng)”的色譜條件下測得的尿酸 HPLC色譜圖見圖 2.5。

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本文編號：2794379