【摘要】：在兒童肝臟的惡性腫瘤中,肝母細(xì)胞瘤(Hepatoblastoma,HB)占首位。統(tǒng)計(jì)數(shù)據(jù)表明,HB的發(fā)病率約為1.2-1.5/106,且大多數(shù)發(fā)生于5歲以前。HB的臨床治療以手術(shù)和化療為主。少數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)處于早期,可手術(shù)完全切除。切除后如果存在危險(xiǎn)因素,需要進(jìn)行輔助化療。病灶不能完全切除的患者,實(shí)行新輔助化療可降低疾病分期,爭(zhēng)取切除機(jī)會(huì)。晚期患者的治療主要以化療和支持治療為主。得益于新型治療藥物的開(kāi)發(fā)和手術(shù)方式的進(jìn)步,HB的生存率較以往已經(jīng)有了較大的提高�；煵粌H有利于提高手術(shù)治療的可能行,還能有效提高無(wú)法切除患者和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移患者的生存率。但是,常規(guī)化療強(qiáng)烈的毒副作用限制了HB療效的進(jìn)一步提高。目前,臨床治療的主要策略是控制化療藥物劑量和開(kāi)發(fā)新的治療藥物,以減少化療相關(guān)毒性事件的發(fā)生,從而改善HB患者的整體預(yù)后。中藥中有大量的藥物被證實(shí)具有抗腫瘤活性,為遴選新的抗腫瘤藥物提供了資源。土貝母長(zhǎng)期以來(lái)被用來(lái)治療包括腫瘤在內(nèi)的多種內(nèi)外科疾病。現(xiàn)代研究證實(shí),其主要有效成分皂苷類具有廣譜的抗腫瘤活性,能誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。鮮土貝母二氯甲烷提取物(ETBM)不同于以往提取方式所獲得的的化合物。實(shí)驗(yàn)證實(shí),ETBM能有效抑制轉(zhuǎn)移性三陰乳腺癌的增殖和轉(zhuǎn)移,具有開(kāi)發(fā)成新型抗腫瘤藥物的潛質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)將ETBM應(yīng)用于HB細(xì)胞系及裸鼠移植瘤模型,觀察其抑制裸鼠移植瘤生長(zhǎng)的效果,探討其抗HB的機(jī)制。以期為開(kāi)發(fā)新的抗HB藥物提供線索。本實(shí)驗(yàn)用HepG2細(xì)胞作為HB的細(xì)胞模型,用裸鼠皮下移植瘤作為HB的疾病模型,通過(guò)分析細(xì)胞增殖、觀察形態(tài)學(xué)改變、檢測(cè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)關(guān)鍵蛋白等多種實(shí)驗(yàn)手段揭示ETBM抗HB的機(jī)制。實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn),ETBM對(duì)HepG2細(xì)胞具有劑量依賴的抑制作用,其IC50為113.10±12.13μg/ml。ETBM處理過(guò)的HepG2細(xì)胞內(nèi)可見(jiàn)大量空泡產(chǎn)生。發(fā)生空泡化的細(xì)胞在電鏡下可見(jiàn)胞質(zhì)內(nèi)結(jié)構(gòu)清晰的自噬小體和自噬溶酶體。免疫印跡實(shí)驗(yàn)可見(jiàn)自噬標(biāo)志性蛋白LC3Ⅱ和p62的表達(dá)發(fā)生顯著改變(P0.05)。免疫熒光分析可見(jiàn)LC3Ⅱ和p62的表達(dá)和分布發(fā)生顯著性改變。由此可推斷,ETBM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生了自噬,且自噬程度與ETBM濃度成正比。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)以檢驗(yàn)ETBM抑制HepG2增殖時(shí)是否發(fā)生細(xì)胞凋亡和周期阻滯。結(jié)果顯示,不同濃度ETBM作用HepG2細(xì)胞12小時(shí)或24小時(shí),均未見(jiàn)細(xì)胞發(fā)生早凋亡或周期阻滯。說(shuō)明ETBM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生自噬不伴有細(xì)胞凋亡或細(xì)胞周期阻滯。據(jù)此推測(cè)ETBM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生了自噬性細(xì)胞死亡(Autophagic cell death,ACD)。為證實(shí)這一推論,本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用了自噬抑制劑PIK-Ⅲ以抑制ETBM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生的自噬。結(jié)果發(fā)現(xiàn),PIK-Ⅲ單獨(dú)或與ETBM同時(shí)作用于HepG2細(xì)胞,胞質(zhì)內(nèi)可見(jiàn)大量空泡化形成,但電鏡下并未發(fā)現(xiàn)自噬小體和自噬溶酶體。不僅如此,LC31I和p62的表達(dá)和在細(xì)胞內(nèi)的分布也指向與自噬水平被抑制的狀態(tài)。說(shuō)明PDC-Ⅲ能抑制ETBM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生的自噬。按照細(xì)胞死亡命名委員會(huì)(The Nomenc-lature Committee on Cell Death,NCCD)的標(biāo)準(zhǔn),ETBM誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生了ACD,是其發(fā)揮抗肝母細(xì)胞瘤的主要機(jī)制。本實(shí)驗(yàn)將HepG2細(xì)胞用PBS-基質(zhì)膠混合溶液重懸后接種于裸鼠腋下皮下,其成瘤率約為83.33%,而單純使用PBS重懸后接種的成率約為16.67%(P0.01)。BS-基質(zhì)膠混合溶液重懸HepG2細(xì)胞后接種作為裸鼠移植瘤模型的造模方法。造模成功后隨機(jī)分組,別給予去離子水灌胃、奧沙利鉑腹腔注射、ETBM低濃度和高濃度灌胃4周。結(jié)果發(fā)現(xiàn),奧沙利鉑能顯著抑制裸鼠移植瘤的生長(zhǎng),其腫瘤抑制率約為56.73%,低劑量ETBM的腫瘤抑制率為34.93%,高劑量ETBM的腫瘤抑制率為37.88%(高低計(jì)量之間無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異)。奧沙利鉑組小鼠體重持續(xù)降低,明顯低于其余各組(P0.05),ETBM組與正常組之間無(wú)差異(P0.05),說(shuō)明奧沙利鉑具有較強(qiáng)的毒性,而ETBM的耐受性較好。本實(shí)驗(yàn)應(yīng)用高效液相色譜-時(shí)間飛行質(zhì)譜(High performance liquid chromate-graphy time off-flight mass spectrome-try,HPLC-TOF MS)分析了ETBM所含的活性成分,共鑒定出10種含量較高化合物。其中豆留醇和葫蘆素E等在既往研究中被證實(shí)具有廣泛的抗腫瘤活性,能有誘導(dǎo)多種腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡和周期阻滯。ETBM抑制HepG2細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)ACD的具體化合物有待進(jìn)一步研究。綜上所述,ETBM在體內(nèi)能明顯抑制HB移植瘤的生長(zhǎng),且具有良好的耐受性,在體外能通過(guò)誘導(dǎo)HepG2細(xì)胞發(fā)生ACD發(fā)揮抗腫瘤活性。
【學(xué)位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

２．３結(jié)果逡逑ＥＴＢＭ作用過(guò)的ＨｅｐＧ２細(xì)胞在光學(xué)顯微鏡下仍可見(jiàn)胞質(zhì)空泡化形成，而作逡逑為空白對(duì)照的0．１％ＤＭＳＯ組未見(jiàn)明顯空泡化。透射電鏡可觀察到（圖２），逡逑０．１％ＤＭＳＯ組可見(jiàn)明顯細(xì)胞亞結(jié)構(gòu)（綠色箭頭為橢圓形線粒體）；ＥＴＢＭ逡逑２５ｐｇ／ｍｌ組可見(jiàn)雙側(cè)膜結(jié)構(gòu)的自嗤小體（Ａｕｔｏｐｈａｇｏｓｏｍｅ，ＡＶｉ，黃色箭頭），逡逑ＴＢＭ邋５0ｎｇ／ｍｌ組可見(jiàn)內(nèi)容物己進(jìn)一步降解的單層膜結(jié)構(gòu)的自噬溶酶體（Ａｕｔｏ－逡逑ｌｙｓｏｓｏｍｅ，ＡＶｄ，紅色箭頭）。逡逑ＤＭＳＯ邋０．１％邐ＥＴＢＭ２５Ｍｇ／ｍｌ邐ＥＴＢＭ邋５0ｎｇ／ｍｌ逡逑ｆｔ，邋ｍｍ逡逑＿■魏，n：：逡逑圖２透射電鏡圖像逡逑（綠色剪頭：線粒體；黃色箭頭：自噬小體，ＡＶｉ；紅色箭頭：自噬溶酶體，ＡＶｄ）逡逑６０逡逑

BCA蛋白定量標(biāo)準(zhǔn)曲線

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2 劉s

本文編號(hào)：2792907