【摘要】：目的:采集不同地點(diǎn)和不同時(shí)期的中國(guó)林蛙,確定中國(guó)林蛙哈蟆油中多不飽和脂肪酸的組成及含量變化規(guī)律;對(duì)哈蟆油進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,得到哈蟆油多不飽和脂肪酸合成途徑,并找到關(guān)鍵酶基因;對(duì)哈蟆油進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量測(cè)定,探討哈蟆油不同時(shí)期的表達(dá)量,從而獲得高質(zhì)量的哈蟆油;進(jìn)一步將獲得的高質(zhì)量哈蟆油采用固體分散體技術(shù)制備成劑型,并建立制劑質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),對(duì)制劑的穩(wěn)定性和急性毒性進(jìn)行研究,并進(jìn)行劑型的免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。方法:采集不同地點(diǎn)和不同時(shí)期的中國(guó)林蛙樣品,取中國(guó)林蛙的輸卵管,-80.0℃冰箱備存,提取哈蟆油中多不飽和脂肪酸并甲酯化,采用氣相色譜法測(cè)定其多不飽和脂肪酸的含量,采用美國(guó)StatView軟件分析多不飽和脂肪酸的組成及相對(duì)含量;并分析多不飽和脂肪酸的變化規(guī)律,探究哈蟆油質(zhì)量最好的區(qū)域和最佳的采集時(shí)期。為了確定哈蟆油多不飽和脂肪酸累積途徑,對(duì)哈蟆油進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序,生成數(shù)據(jù)庫(kù),并進(jìn)行分析和統(tǒng)計(jì),獲得哈蟆油多不飽和脂肪酸合成途徑及影響哈蟆油中多不飽和脂肪酸的關(guān)鍵酶基因。采用Trizol法提取哈蟆油中的RNA,使用Nanodrop 2000超微量紫外/可見(jiàn)光分光光度計(jì)對(duì)RNA濃度和質(zhì)量進(jìn)行檢測(cè),采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)總RNA的完整性;采用Takara公司的試劑盒將哈蟆油中的總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR檢測(cè)脂肪酸脫氫酶基因在哈蟆油不同時(shí)期中的表達(dá)量,與測(cè)定各時(shí)期哈蟆油中多不飽和脂肪酸的含量相比較,獲得高質(zhì)量的哈蟆油,進(jìn)一步將獲得的高質(zhì)量哈蟆油采用固體分散體技術(shù)制備成劑型,并建立最佳劑型的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),進(jìn)行穩(wěn)定性、急性毒性研究,并采用小鼠動(dòng)物實(shí)驗(yàn)進(jìn)行哈蟆油最佳制劑的免疫實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證。結(jié)果:采用氣相色譜法測(cè)定中國(guó)林蛙不同地點(diǎn)和不同時(shí)期中哈蟆油多不飽和脂肪酸含量,結(jié)果發(fā)現(xiàn)中國(guó)吉林省靖宇縣三道湖鎮(zhèn)漿源中國(guó)林蛙養(yǎng)殖廠基地的哈蟆油中多不飽和脂肪酸含量最高,并且發(fā)現(xiàn)哈蟆油中的多不飽和脂肪酸含量在散居冬眠期(11~12月)時(shí)達(dá)到最高。通過(guò)對(duì)哈蟆油轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果分析,找到哈蟆油多不飽和脂肪酸的合成途徑及影響哈蟆油中多不飽和脂肪酸含量的脂肪酸脫氫酶基因。采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定哈蟆油不同時(shí)期的表達(dá)量,發(fā)現(xiàn)在散居冬眠期(11~12月)時(shí)表達(dá)量最高。采用固體分散體技術(shù)將獲得的高質(zhì)量哈蟆油制備成滴丸劑,基質(zhì)為聚乙二醇4000,藥物與聚乙二醇4000的比例為1:3,冷凝液為甲基硅油(100mm~2/s):輕質(zhì)液狀石蠟(1:1),藥物與基質(zhì)熔融溫度為70℃。建立哈蟆油滴丸質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn),符合2015版《中國(guó)藥典》標(biāo)準(zhǔn),穩(wěn)定性試驗(yàn)符合要求。證明哈蟆油滴丸屬實(shí)際無(wú)毒級(jí)。經(jīng)口給予小鼠不同劑量的哈蟆油滴丸30天,能增強(qiáng)小鼠遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng),說(shuō)明哈蟆油滴丸能增強(qiáng)細(xì)胞免疫功能;并且試驗(yàn)結(jié)果表明能提高小鼠單核 巨噬細(xì)胞的碳廓清能力,說(shuō)明哈蟆油滴丸能增強(qiáng)單核-巨噬細(xì)胞功能。結(jié)論:哈蟆油中的多不飽和脂肪酸含量在中國(guó)林蛙散居冬眠期(11~12月)時(shí)最高,與實(shí)時(shí)熒光定量PCR測(cè)定哈蟆油不同時(shí)期的表達(dá)量結(jié)果相符,并確定哈蟆油多不飽和脂肪酸生物合成的途徑,找到關(guān)鍵酶基因;將獲得的高質(zhì)量哈蟆油采用固體分散體技術(shù)制備成滴丸劑,質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)符合2015版《中國(guó)藥典》規(guī)定,免疫試驗(yàn)證明哈蟆油滴丸能提高免疫力。
【學(xué)位授予單位】：長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類(lèi)號(hào)】：R283.6
【圖文】：

3.1 考察氣相色譜儀器在氣相色譜條件各個(gè)參數(shù)相同的情況下，我們考察了島津 GC2014（C）氣相色譜儀和安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。圖1 島津 GC2014（C）氣相色譜儀的氣相色譜圖圖2 安捷倫GC7890b氣相色譜儀的氣相色譜圖結(jié)果表明，使用島津 GC2014（C）氣相色譜儀進(jìn)行考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)氣相色譜基線不平，更改使用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀時(shí)，氣相色譜基線漂移情況好轉(zhuǎn)。所以本試驗(yàn)采用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀進(jìn)行試驗(yàn)。3.2 氣相色譜柱的老化在做氣相色譜儀器試驗(yàn)時(shí)，新的氣相色譜毛細(xì)管柱子都需要進(jìn)行老化，目的是使

3.1 考察氣相色譜儀器在氣相色譜條件各個(gè)參數(shù)相同的情況下，我們考察了島津 GC2014（C）氣相色譜儀和安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀，結(jié)果見(jiàn)圖1和圖2。圖1 島津 GC2014（C）氣相色譜儀的氣相色譜圖圖2 安捷倫GC7890b氣相色譜儀的氣相色譜圖結(jié)果表明，使用島津 GC2014（C）氣相色譜儀進(jìn)行考察時(shí)，發(fā)現(xiàn)氣相色譜基線不平，更改使用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀時(shí)，氣相色譜基線漂移情況好轉(zhuǎn)。所以本試驗(yàn)采用安捷倫 GC7890b 氣相色譜儀進(jìn)行試驗(yàn)。3.2 氣相色譜柱的老化在做氣相色譜儀器試驗(yàn)時(shí)，新的氣相色譜毛細(xì)管柱子都需要進(jìn)行老化，目的是使

Hp-88和Supelco公司的SPTM-2560氣相色譜柱，結(jié)果見(jiàn)圖3和圖4。圖3 安捷倫公司的Hp-88色譜柱氣相色譜圖圖4 Supelco公司的SPTM-2560色譜柱氣相色譜圖試驗(yàn)說(shuō)明，使用安捷倫Hp-88氣相色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，三十七種脂肪酸混標(biāo)最多能分離出三十六種，使用Supelco公司的SPTM-2560氣相色譜柱進(jìn)行試驗(yàn)時(shí)，三十七種脂

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本文編號(hào)：2792435