發(fā)布時(shí)間：2020-08-09 11:34

【摘要】：目的動(dòng)脈粥樣硬化(Atherosclerosis,AS)是一種慢性進(jìn)行性炎癥疾病,疾病的發(fā)生涉及多種發(fā)病機(jī)制;其中,血管平滑肌細(xì)胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)的激活、遷移與增殖是AS發(fā)生的重要病理過(guò)程,有研究指出VSMCs增殖與凋亡的失衡是AS發(fā)生過(guò)程中斑塊形成的重要環(huán)節(jié),而高脂血癥是AS發(fā)生發(fā)展的危險(xiǎn)因素。前期研究已證實(shí)中藥水蛭對(duì)早期AS大鼠VSMCs的增殖及表型轉(zhuǎn)化具有一定的抑制作用,同時(shí)能夠調(diào)降血脂,但尚不清楚具體作用機(jī)制。p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路是一條可調(diào)控細(xì)胞增殖與死亡的重要通路,可參與細(xì)胞增殖、分化和凋亡等多種生理過(guò)程;ACAT-2、Fas、HMGCR為肝臟中參與調(diào)節(jié)脂質(zhì)代謝及合成過(guò)程相關(guān)的酶。本研究通過(guò)觀察中藥水蛭對(duì)早期AS大鼠的影響,旨在探索p38MAPK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在AS發(fā)生發(fā)展過(guò)程中對(duì)大鼠VSMCs增殖與凋亡的調(diào)控作用,觀察中藥水蛭干預(yù)過(guò)程中大鼠血脂的動(dòng)態(tài)變化,探討中藥水蛭抗動(dòng)脈粥樣硬化以及調(diào)降A(chǔ)S大鼠血脂的機(jī)制。方法1.建立動(dòng)物模型:采用高脂飼料(High fat diet,HFD)喂養(yǎng)聯(lián)合腹腔注射維生素D_3的方式建立早期AS大鼠模型。40只健康雄性Wistar大鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)1周后,采用數(shù)字隨機(jī)表法將大鼠分為4組:正常對(duì)照組,模型組,水蛭低(0.6g·kg~(-1))、高(1.2 g·kg~(-1))劑量組,每組各10只。分組完成后稱(chēng)量大鼠體重,隨即對(duì)模型組,水蛭低、高劑量組大鼠給予一次性腹腔注射維生素D_3注射液60萬(wàn)IU·kg~(-1),同時(shí)給予HFD喂養(yǎng);對(duì)正常對(duì)照組大鼠給予腹腔注射等量生理鹽水,同時(shí)給予普通飼料喂養(yǎng)。2.中藥水蛭干預(yù):腹腔注射完成后第2天,將配好的中藥水蛭藥液按照劑量分別對(duì)兩水蛭干預(yù)組進(jìn)行灌胃干預(yù)(10mL·kg~(-1)),同時(shí)對(duì)正常對(duì)照組和模型組給予等量蒸餾水灌胃,每天1次,連續(xù)灌胃8周。每周末稱(chēng)大鼠體重1次以調(diào)整灌胃量。3.標(biāo)本收集及檢測(cè):于實(shí)驗(yàn)初及第4周末對(duì)各組大鼠尾靜脈取血檢測(cè)血脂水平;第8周實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí),處死大鼠留取所需組織,同時(shí)依據(jù)體重計(jì)算大鼠肝臟指數(shù);生化分析儀檢測(cè)大鼠血清中TG、TC、LDL-C、HDL-C的水平;使用ELISA法測(cè)定大鼠TGF-β1的水平;免疫組織化學(xué)法(Immunological Histological Chemitry,IHC)檢測(cè)VSMCs中PCNA、Caspase-3表達(dá);TUNEL法檢測(cè)大鼠VSMCs凋亡水平;Western blot檢測(cè)VSMCs中MKK3、P38及C-myc蛋白的表達(dá)和肝臟組織中ACAT-2、Fas、HMGCR的表達(dá)水平;光鏡下觀察大鼠主動(dòng)脈弓蘇木素-伊紅(HE)染色后的病理改變;大鼠肝臟組織油紅O染色后觀察肝臟脂質(zhì)沉積情況。結(jié)果1.大鼠體重、肝臟指數(shù)的改變:實(shí)驗(yàn)開(kāi)始時(shí),各組大鼠體重?zé)o明顯差異(P0.05);隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程,正常對(duì)照組大鼠體重呈現(xiàn)穩(wěn)步增長(zhǎng)趨勢(shì),模型組大鼠體重增長(zhǎng)稍緩慢,體重低于正常對(duì)照組(P0.01);兩水蛭干預(yù)組大鼠體重增長(zhǎng)較平穩(wěn),體重高于模型組(P0.01),兩水蛭干預(yù)組之間體重?zé)o明顯差異。模型組大鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)明顯高于對(duì)照組,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);水蛭干預(yù)組大鼠的肝臟質(zhì)量及肝臟指數(shù)較模型組大鼠低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01)。2.大鼠血清血脂水平的變化:實(shí)驗(yàn)初,各組大鼠TG、TC、LDL-C、HDL-C差異不明顯(P0.05);隨著實(shí)驗(yàn)的進(jìn)行直至結(jié)束,各組大鼠TG水平差異不明顯(P0.05);第4、8周時(shí),與正常對(duì)照組比較,模型組TC和LDL-C水平顯著升高,HDL-C逐漸降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與模型組比較,水蛭高低劑量組TC和LDL-C水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),水蛭低劑量組較高劑量組有所降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);水蛭高低劑量組較模型組HDL-C有升高趨勢(shì),但兩組間HDL-C水平在實(shí)驗(yàn)期間無(wú)明顯差異(P0.05)。3.血清TGF-β1表達(dá)水平的變化:模型組TGF-β1較正常對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);水蛭各干預(yù)組TGF-β1明顯較模型組降低,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);兩水蛭干預(yù)組組間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.大鼠VSMCs中MKK3、P38及C-myc蛋白表達(dá)的改變:與正常對(duì)照組相比較,模型組的P38和C-myc蛋白表達(dá)增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),MKK3表達(dá)水平差異不明顯,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);水蛭各干預(yù)組的MKK3、P38、C-myc蛋白表達(dá)明顯較模型組降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與水蛭低劑量組比較,水蛭高劑量組的MKK3及C-myc蛋白表達(dá)輕度增加,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),P38表達(dá)水平差異不具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。5.大鼠肝臟組織中ACAT-2、Fas、HMGCR的表達(dá)水平:與正常對(duì)照組比較,模型組大鼠肝臟的ACAT-2、Fas及HMGCR水平明顯升高,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與模型組比較,水蛭高低劑量組大鼠肝臟ACAT-2、Fas及HMGCR水平明顯降低,差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),同時(shí),水蛭高劑量組大鼠肝臟HMGCR水平較水蛭低劑量組有降低趨勢(shì)(P0.05),兩者的ACAT-2、Fas水平無(wú)明顯差異(P0.05)。6.大鼠VSMCs中PCNA、Caspase-3表達(dá)的變化:模型組的PCNA較正常對(duì)照組明顯升高,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),Caspase-3輕度升高,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05);水蛭各干預(yù)組PCNA較模型組明顯降低,Caspase-3明顯升高,差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01);與水蛭低劑量組相比,水蛭高劑量組PCNA有所升高,Caspase-3有所較降低,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。7.大鼠VSMCs凋亡率的比較:與正常對(duì)照組相比較,模型組大鼠VSMCs凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比無(wú)明顯差異(P0.05),表明正常對(duì)照組與模型對(duì)照組之間大鼠VSMCs凋亡率差異不明顯;與模型組相比,中藥水蛭各干預(yù)組大鼠VSMCs凋亡陽(yáng)性細(xì)胞百分比明顯升高(P0.01),表明中藥水蛭干預(yù)組大鼠VSMCs凋亡率較模型組高。8.大鼠血清TGF-β1的表達(dá)水平與Caspase-3及VSMCs的凋亡率呈負(fù)相關(guān)(r分別為-0.412與-0.394),與MKK3、PCNA、P38、C-myc、ACAT-2、Fas及HMGCR的表達(dá)水平呈正相關(guān)(r分別為0.434,0.774,0.656,0.661,0.725,0.791,0.870),差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。9.主動(dòng)脈形態(tài)學(xué)改變:光鏡下觀察胸主動(dòng)脈HE染色切片(200倍視野),可見(jiàn)正常對(duì)照組大鼠主動(dòng)脈內(nèi)膜完整、光滑,VSMCs排列整齊,未見(jiàn)明顯膽固醇結(jié)晶沉積及斑塊形成;模型組主動(dòng)脈內(nèi)膜不平整,可見(jiàn)明顯向腔內(nèi)凸起的斑塊,內(nèi)、中膜明顯增厚,VSMCs增生、排列紊亂,可見(jiàn)膽固醇結(jié)晶沉積,明顯斑塊形成;水蛭各干預(yù)組主動(dòng)脈病理改變較模型組均有不同程度減輕,可見(jiàn)水蛭低劑量組主動(dòng)脈內(nèi)中膜增厚較輕,內(nèi)膜下少量斑塊形成,斑塊內(nèi)有少量膽固醇結(jié)晶,VSMCs排列較整齊,水蛭高劑量組可見(jiàn)少量斑塊及膽固醇結(jié)晶沉積,VSMCs排列較為整齊,斑塊較少。10.大鼠肝臟肉眼及油紅O染色觀察:正常對(duì)照組大鼠肝臟表面光滑,色澤紅潤(rùn),邊緣較銳,呈現(xiàn)紅褐色,質(zhì)地較韌;模型組大鼠肝臟彌漫腫大感,表面光滑,邊緣鈍厚,呈蒼白色,質(zhì)軟顆粒感,伴油膩感;水蛭低劑量組大鼠肝臟顏色呈淡紅褐色,邊緣稍鈍,質(zhì)軟,與模型組比較,體積稍小,顆粒感、油膩感輕;水蛭高劑量組大鼠肝臟顏色稍蒼白,邊緣稍鈍,質(zhì)軟,與模型組比較,體積稍小,顆粒感、油膩感輕,但肝臟顆粒感、油膩感較水蛭低劑量組明顯。正常對(duì)照組大鼠肝臟未見(jiàn)明顯脂滴沉積,模型組大鼠肝臟可見(jiàn)明顯脂滴沉積,呈彌漫性;與模型組比較,水蛭高低劑量組大鼠肝臟脂滴沉積減少,但水蛭高劑量組大鼠肝臟脂滴沉積較水蛭低劑量組明顯。結(jié)論研究結(jié)果表明中藥水蛭可干預(yù)AS的發(fā)生進(jìn)程,可能的機(jī)制為:1.中藥水蛭可降低早期AS大鼠的血清TC及LDL-C的水平,同時(shí)可使血清中HDL-C的水平升高,進(jìn)而減少大鼠血管內(nèi)膜上的脂質(zhì)沉積;2.經(jīng)過(guò)中藥水蛭的干預(yù),大鼠肝臟指數(shù)明顯降低,影響大鼠肝臟中與脂質(zhì)代謝有關(guān)的酶ACAT-2、Fas及HMGCR的表達(dá)來(lái)調(diào)降血脂;3.中藥水蛭可降低大鼠血清TGF-β1的表達(dá)以降低VSMCs的增殖;4.中藥水蛭可降低PCNA的表達(dá)以抑制VSMCs的增殖,上調(diào)Caspase-3的表達(dá)而促進(jìn)VSMCs的凋亡;5.中藥水蛭可調(diào)降p38MAPK信號(hào)通路蛋白MKK3、P38及C-myc蛋白的表達(dá)水平,調(diào)控VSMCs的增殖與凋亡來(lái)影響AS進(jìn)程。
【學(xué)位授予單位】：天津醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

表 5 各組大鼠 VSMCs 凋亡率比較Table 5 The apoptosis rate of VSMCs in rats（ x ±s, n =組別 劑量/（g kg-1） 陽(yáng)性細(xì)胞百分比（正常對(duì)照組 - 2.10±0.64模型組 - 2.45±0.911)水蛭低劑量組 0.6 7.01±0.752)水蛭高劑量組 1.2 7.15±0.602)注：與正常對(duì)照組相比，1)P >0.05；與模型對(duì)照組相比,2)P <0.01a.正常對(duì)照組 b.模型組

6 The average optical density value of PCNAand Caspase-3of rats （ x ±s, n =7）組別 劑量/（g kg-1） PCNA Caspase-3正常對(duì)照組 - 0.115±0.017 0.171±0.030模型組 - 0.238±0.0361)0.187±0.018水蛭低劑量組 0.6 0.129±0.0342)0.293±0.0302水蛭高劑量組 1.2 0.137±0.0372)0.274±0.0402注：與正常對(duì)照組相比，1)P <0.01；與模型對(duì)照組相比,2)P <0.01a.正常對(duì)照組 b.模型組

c.水蛭低劑量組 d.水蛭高劑量組 3 各組大鼠 VSMCs 的 Caspase-3 免疫組化染色（SABC，×400）g.3 The Caspase-3 immunohistochemical staining in VSMCs of rats（SABC，×40注：細(xì)胞胞漿顯棕黃色為 Caspase-3 陽(yáng)性染色。關(guān)蛋白 Western blot 檢測(cè) 大鼠血管平滑肌細(xì)胞 MKK3、P38 及 C-myc 蛋白表達(dá)水平與正常對(duì)照組相比較，模型組的 P38 和 C-myc 蛋白表達(dá)增加，差異意義（P <0.01），MKK3 表達(dá)水平差異不明顯，無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >干預(yù)組的 MKK3、p38、C-myc 蛋白表達(dá)明顯較模型對(duì)照組降低，差學(xué)意義（P <0.01）；與水蛭低劑量組比較，水蛭高劑量組的 MKK3 及 達(dá)輕度增加，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P <0.05），P38 表達(dá)水平差異不統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P >0.05）,見(jiàn)表 7，圖 4。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2787061