【摘要】：結(jié)核病(Tuberculosis,TB)是由結(jié)核分枝桿菌(Mycobacterium tuberculosis,MTB)引起的高感染和高致死性的慢性傳染病。近年來(lái),由于耐多藥結(jié)核病(MDR-TB)和廣泛耐藥結(jié)核病(XDR-TB)的出現(xiàn),以及結(jié)核病與艾滋病的交叉感染,使結(jié)核病的致死率已超過(guò)艾滋病位居第九,無(wú)疑給人類健康帶來(lái)嚴(yán)重的威脅。盡管已有治療結(jié)核的藥物,但是治療時(shí)間過(guò)長(zhǎng)(6-9月),導(dǎo)致部分病人不能堅(jiān)持服藥,引起耐藥菌出現(xiàn);另外,由于部分抗結(jié)核藥物肝毒性明顯,長(zhǎng)期服藥可導(dǎo)致病人肝損傷。因此,發(fā)現(xiàn)新型藥物,縮短結(jié)核治療時(shí)間是近年來(lái)研究熱點(diǎn)。大量研究證明,結(jié)核分枝桿菌形成生物膜(Biofilm,BF),能使結(jié)核分枝桿菌產(chǎn)生表型耐藥,是結(jié)核分枝桿菌耐藥的重要機(jī)制之一,如果抑制結(jié)核桿菌生物膜的形成或破壞已形成的生物膜,將有利于細(xì)菌恢復(fù)對(duì)抗癆藥物的敏感性,從而提高結(jié)核病的治療效果,縮短治療周期。中草藥是新藥發(fā)現(xiàn)的重要來(lái)源之一,我國(guó)中草藥資源豐富,品種繁多,本項(xiàng)目組前期利用貴州中草藥資源的多樣性,以及豐富的民族藥資源,進(jìn)行過(guò)篩選試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)侗族民間治療結(jié)核的單味藥瑤山南星(Arisaema sinii Krause)具有抑制結(jié)核桿菌生物膜的活性。本實(shí)驗(yàn)研究了瑤山南星抑制結(jié)核桿菌生物膜的活性成分并進(jìn)行了初步機(jī)制探討。首先,采用熱回流方法,獲得瑤山南星乙醇提取物。然后進(jìn)行萃取分段,分別得到石油醚層萃取部位、乙酸乙酯層萃取部位、剩余層。采用生物膜形成計(jì)分法評(píng)價(jià)抗生物膜活性,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,石油醚層萃取部位具有較好的抑制結(jié)核桿菌生物膜形成的活性,呈明顯的量效關(guān)系,藥物濃度為1mg/mL時(shí),生物膜計(jì)分為2.0,藥物濃度為2mg/mL時(shí),生物膜計(jì)分為1.3。采用改良羅氏培養(yǎng)基絕對(duì)濃度法測(cè)定不同部位的體外抗結(jié)核桿菌活性,發(fā)現(xiàn)石油醚層萃取部位無(wú)抑制結(jié)核桿菌的活性,而乙酸乙酯部位具有抗菌活性(MIC=1mg/mL)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示,瑤山南星乙醇提取物既具有抑制結(jié)核桿菌生物膜的化合物,同時(shí)還存在抗結(jié)核桿菌的化合物。為分離瑤山南星生物膜抑制劑,本實(shí)驗(yàn)采用硅膠柱色譜進(jìn)一步對(duì)石油醚層進(jìn)行分段,并測(cè)試不同組分的活性,經(jīng)過(guò)反復(fù)過(guò)柱純化,分離得到抑制結(jié)核桿菌生物膜的化合物單體YS-01(80 mg)。化合物YS-01為灰白色油狀物,ESI-MS m/z:601.2[M+H]~+,~1H NMR(500 MHz,CDCl_3-d6):7.70(s,-NH-,1H),7.53(s,-NH-,1H),6.23-5.49(t,3H),6.03(d,1H),5.50(s,J=8.2 Hz,Dp-CH-,2H),5.45(dt,J=18.1 Hz,3H),5.21-4.67(m,7H),2.48(dt,4H),2.21(dt,4H),1.87(dt,J=14.9 Hz,4H),1.63(t,2H),1.64-0.97(d,15H),1.34-0.86(d,9H),0.95-0.77(t,3H),~(13)C NMR(100 MHz,CDCl_3-d6)δ199.76,171.82,167.77,132.44,130.88,128.80,123.72,68.16,55.99,55.87,53.80,45.81,42.38,39.61,38.72,36.11,35.61,33.97,32.96,32.04,30.35,29.69,28.92,28.19,26.04,24.18,23.74,22.98,21.02,19.81,19.01,18.69,17.38,14.05,11.94,10.95。鑒定為:3,6,8-三甲基癸-1-烯-1-基3,6-二氧代-5-(4,8,10,13-四甲基十四碳-2,6-二烯�；�)-哌嗪-2-羧酸甲酯。采用生物膜計(jì)分法,發(fā)現(xiàn)YS-01在濃度為4μg/mL時(shí),能抑制結(jié)核桿菌生物膜形成,8μg/mL時(shí),生物膜基本不能形成。掃描電子顯微鏡觀察到在活性單體藥物濃度為32μg/mL時(shí),可破壞已經(jīng)形成的結(jié)核桿菌生物膜。YS-01與一線抗癆藥物聯(lián)用,體外抗BCG活性實(shí)驗(yàn)表明,YS-01與一線抗結(jié)核藥物異煙肼(1/2MIC)、利福平(1/2 MIC)和吡嗪酰胺(1/2 MIC)聯(lián)用后,均表現(xiàn)出良好的協(xié)同作用。Pks1基因與結(jié)核桿菌生物膜形成有關(guān),該基因表達(dá)產(chǎn)物為聚酮合成酶,聚酮類脂肪酸是結(jié)核桿菌生物膜的主要成分。利用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù),初步探索活性單體化合物YS-01對(duì)結(jié)核分枝桿菌H37Rv菌株中Pks1基因的表達(dá)調(diào)控的影響,采用2~(-??)Ct法進(jìn)行結(jié)果分析,實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白對(duì)照比較,被化合物單體YS-01干預(yù)后的結(jié)核桿菌,基因Pks1表達(dá)量明顯上調(diào),其2~(-??)值是空白對(duì)照的93倍。為此,我們推測(cè)YS-01是結(jié)核桿菌聚酮合成酶抑制劑。綜上所述,本論文對(duì)瑤山南星抗結(jié)核桿菌生物膜活性進(jìn)行了評(píng)價(jià),跟蹤分離得到有效單體化合物,鑒定了化合物的結(jié)構(gòu),初步探討了其抑制結(jié)核桿菌生物膜形成的分子機(jī)制,為研發(fā)抗結(jié)核藥物提供了新的思路。
【學(xué)位授予單位】：貴州大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284
【圖文】：

圖 2-1 瑤山南星Figure 2-1 Arisaema sinii Krausesaema sinii Krause）：天南星科（Araceae）天中藥材市場(chǎng)，為瑤山南星塊莖部位，2000核分枝桿菌 H37Rv，貴陽(yáng)市肺科醫(yī)院結(jié)核（購(gòu)自 ATCC）。程中嚴(yán)格遵守?zé)o菌操作等規(guī)程，嚴(yán)格執(zhí)行。

圖 2-4 瑤山南星石油醚萃取部位抗結(jié)核分枝桿菌結(jié)果Figure 2-4 Results of anti-tuberculous mycobacteria in the extraction site of petroleum ether ofArisaema sinii Krause注：從左到右的藥物濃度依次為：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、空白。Note：From left to right：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、Blank。

圖 2-4 瑤山南星石油醚萃取部位抗結(jié)核分枝桿菌結(jié)果Figure 2-4 Results of anti-tuberculous mycobacteria in the extraction site of petroleum ether ofArisaema sinii Krause注：從左到右的藥物濃度依次為：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、空白。Note：From left to right：2mg/mL、1mg/mL、0.5mg/mL、Blank。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2779578