【摘要】：桑葚是�？浦参锷５某墒旃�,因含有豐富的營(yíng)養(yǎng)成分和化學(xué)活性物質(zhì),表現(xiàn)出多種藥用價(jià)值,被同時(shí)收載于《中國(guó)藥典》2015版第一部及藥食同源原料目錄(2017)。桑葚多糖是桑葚中高含量成分之一,部分研究已表明桑葚多糖具有抗氧化、免疫調(diào)節(jié)、降血糖等多種生物活性。此外,本課題組前期研究還發(fā)現(xiàn)桑葚多糖有良好的抗酒精性肝損傷作用,可能是一種治療酒精性肝損傷的潛在物質(zhì)。多糖屬于一類天然高分子聚合物,分子量大,結(jié)構(gòu)復(fù)雜,其結(jié)構(gòu)直接或間接地影響自身生物活性的展現(xiàn)。然而,大多數(shù)多糖結(jié)構(gòu)尚未明確,并且不同的分離純化方法也可能獲得不同質(zhì)量不同類型的精制多糖,影響其生物活性、藥效及構(gòu)效關(guān)系的研究結(jié)果。因此為了更全面的認(rèn)識(shí)桑葚多糖,深入了解不同桑葚多糖對(duì)酒精性肝損傷的影響,本文擬以乙醇分級(jí)醇沉方式獲得桑葚多糖,展開桑葚多糖抗酒精性肝損傷作用的研究,為解酒保肝的醫(yī)藥和保健品領(lǐng)域提供物質(zhì)基礎(chǔ),并促進(jìn)桑葚多糖的開發(fā)和利用。但由于工作量大,碩士研究生階段時(shí)間有限,本論文選擇弱極性乙醇分級(jí)醇沉的桑葚多糖作為物質(zhì)研究基礎(chǔ)。本研究采用弱極性分級(jí)醇沉的方法初步純化,再利用柱層析法進(jìn)一步分離純化獲得精制桑葚多糖,從理化性質(zhì)、分子量、單糖組成、結(jié)構(gòu)特征,對(duì)精制桑葚多糖進(jìn)行簡(jiǎn)單的結(jié)構(gòu)表征;其次,運(yùn)用不同化學(xué)修飾方法對(duì)精制桑葚多糖進(jìn)行分子修飾,進(jìn)而獲得不同結(jié)構(gòu)的桑葚多糖衍生物,為本研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。以獲得的桑葚多糖及衍生物為研究對(duì)象,在體外建立乙醇脫氫酶活性(ADH)模型,以體外ADH活性的激活率為評(píng)價(jià)標(biāo)準(zhǔn),篩選具有較好ADH活性的桑葚多糖;最后在此基礎(chǔ)上,以篩選結(jié)果為對(duì)象,建立急性酒精性肝損傷動(dòng)物模型,通過動(dòng)物血清、肝臟生化指標(biāo)和病理切片,系統(tǒng)評(píng)價(jià)桑葚多糖及其衍生物對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用。最終主要研究結(jié)果如下:(1)桑葚多糖的提取、分離純化桑葚干品經(jīng)粉碎、脫脂、熱水浸提、70%和90%分級(jí)醇沉、脫蛋白、DEAE-52纖維素柱、Sephadex G-100凝膠柱層析分離純化獲得兩種均一中性桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)和兩種均一酸性桑葚多糖(MFPs-70-2、MFPs-90-2)。(2)桑葚多糖的結(jié)構(gòu)初步表征桑葚多糖的結(jié)構(gòu)初步表征主要圍繞其理化性質(zhì)、分子量、單糖組成、結(jié)構(gòu)特征進(jìn)行。結(jié)果顯示:4組分桑葚多糖的總糖含量、蛋白含量、糖醛酸含量、分子量及單糖組成均不一樣。MFPs-70-1含總糖87.64%、蛋白質(zhì)1.29%、糖醛酸6.26%、分子量為316 k Da,并由甘露糖11.0%、鼠李糖5.4%、半乳糖醛酸4.7%、葡萄糖33.5%和木糖45.5%組成;MFPs-90-1含總糖91.33%,蛋白質(zhì)0.32%、糖醛酸5.53%,分子量為398 k Da,并由甘露糖7.2%、鼠李糖1.4%、葡萄糖28.6%和木糖62.8%組成;MFPs-70-2總糖60.27%、蛋白質(zhì)1.06%、糖醛酸11.95%、分子量1584 k Da,并由甘露糖18.8%、鼠李糖4.6%、葡萄糖醛酸6.2%、半乳糖醛酸1.5%、葡萄糖34.7%、木糖25.5%和阿拉伯糖8.7%組成;MFPs-90-2含總糖71.41%、蛋白質(zhì)0.56%、糖醛酸10.46%、分子量為229.1 k Da,并由甘露糖5.8%、鼠李糖15.4%、葡萄糖醛酸3.0%、半乳糖醛酸2.9%、葡萄糖36.5%、木糖21.2%、阿拉伯糖15.1%組成。并經(jīng)紅外光譜掃描發(fā)現(xiàn):MFPs-70-1、MFPs-70-2、MFPs-90-1、MFPs-90-2可能均是含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的桑葚多糖,此外MF Ps-70-2、MFPs-90-2可能還含有β-糖苷鍵。(3)桑葚多糖的分子修飾MFPs-70-1、MFPs-70-2、MFPs-90-1、MFPs-90-2經(jīng)硫酸化修飾分別得到S-MFPs-70-1、S-MFPs-70-2、S-MFPs-90-1、S-MFPs-90-2,其取代度分別為0.33、0.58、0.55、0.40,得率分別為22.76%、27.93%、21.15%、23.05%。紅外光譜掃描顯示4組硫酸化衍生物均保留原多糖的結(jié)構(gòu),并且S-MFPs-70-1、S-MFPs-70-2、S-MFPs-90-1、S-MFPs-90-2分別在1146.32 cm-1、1149.62 cm-1、1147.21 cm-1、1143.27 cm-1出現(xiàn)強(qiáng)吸收峰,這是S=O結(jié)構(gòu)的振動(dòng)信號(hào),說明桑葚多糖硫酸化修飾成功。MFPs-70-1、MFPs-90-1、MFPs-70-2、MFPs-90-2經(jīng)羧甲基化修飾得到C-MFPs-70-1、C-MFPs-70-2、C-MFPs-90-1、C-MFPs-90-2,其取代度分別為0.49、0.52、0.41、0.33,得率分別為17.23%、30.68%、27.56%、28.33%。并經(jīng)紅外光譜掃描四組羧甲基化衍生物也保留著原多糖的結(jié)構(gòu);此外,C-MFPs-70-1、C-MFPs-90-1、C-MFPs-70-2、C-MFPs-90-2在1600~1400 cm-1附近的-COO-的信號(hào)增強(qiáng),說明桑葚多糖羧甲基化成功。(4)體外ADH活性激活作用以桑葚多糖及其不同衍生物為研究對(duì)象,展開體外ADH活性的研究。探究桑葚多糖及其不同衍生物對(duì)ADH活性激活作用,確定未修飾組MFPs-70-1、MFPs-90-1、MFPs-70-2、MFPs-90-2及硫酸化衍生物組S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1、S-MFPs-70-2、S-MFPs-90-2均對(duì)乙醇脫氫有激活作用。并通過比較分析,MFPs-70-1、MFPs-90-1體外ADH活性相對(duì)較高(P0.01);當(dāng)桑葚多糖濃度為5 mg·m L-1時(shí),MFPs-70-1、MFPs-90-1激活率分別為58.19%、58.47%。(5)體內(nèi)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用基于ADH活性激活率結(jié)果,選擇MFPs-70-1、MFPs-90-1及相應(yīng)的硫酸化衍生物為研究對(duì)象,建立小鼠急性酒精性肝損傷動(dòng)物模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明:每組桑葚多糖及其硫酸化衍生物(50 mg·kg-1·BW-1)均能控制小鼠體重降低,同時(shí)抑制血液中AST、ALT、TG指標(biāo)水平和肝臟中MDA含量的顯著升高(P0.05)、肝臟中SOD、GSH-Px活力值顯著增高(P0.01),說明弱極性分級(jí)醇沉桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)與其硫酸化衍生物(S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1)能提高小鼠機(jī)體的抗氧化能力,抑制脂質(zhì)過氧化物生成,從而保護(hù)小鼠肝臟受損。其中S-MFPs-90-1組與模型組相比血清AST、ALT、TG指標(biāo)水平和肝臟MDA含量均顯著降低(P0.05),分別降低17.15%、32.34%、21.29%、28.46%;同時(shí)SOD、GSH-Px活力值顯著升高(P0.01),分別增高44.40%、112.61%,表現(xiàn)出相對(duì)較突出的抗氧化作用。通過觀察病理切片發(fā)現(xiàn):模型組小鼠肝細(xì)胞嚴(yán)重破裂變形、細(xì)胞腫脹、細(xì)胞間隔增大、細(xì)胞核裸露;各給藥組小鼠肝臟細(xì)胞破裂程度及細(xì)胞腫脹程度減輕、細(xì)胞間隔減小,肝細(xì)胞損傷得到不同程度的修復(fù)和改善。綜合模型組血清和肝臟生理指標(biāo)及病理切片可知:急性酒精性肝損傷動(dòng)物模型成功建立;弱極性分級(jí)醇沉的桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)及其硫酸化衍生物(S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1)均有抗急性酒精性肝損傷的作用,其中S-MFPs-90-1的效果可能相對(duì)較好。然而,這與在體外ADH激活作用的結(jié)果不同,原因可能與S-MFPs-90-1有良好的抗氧化能力及酒精在肝臟中發(fā)生復(fù)雜的代謝有關(guān)。綜上所述,弱極性分級(jí)醇沉桑葚多糖(MFPs-70-1、MFPs-90-1)及其硫酸化衍生物(S-MFPs-70-1、S-MFPs-90-1)對(duì)酒精所致的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用,可能是潛在的解酒保肝的物質(zhì)。
【學(xué)位授予單位】：貴州師范大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285;TQ464
【圖文】：

貴州師范大學(xué)碩士研究生圖 2-1 MFPs-70（A）、MFPs-90（B） DEAE-52 纖維柱洗脫曲線Fig.2-1 Elution curve of MFPs-70 (A)、MFPs-90 (B) using DEAE-cellulose 52column00.050.10.150.20.250.300.511.522.50 10 20 30 40 50 60aClN度濃olm·L1-A光度吸管數(shù)BBA

貴州師范大學(xué)碩士研究生33圖2-5 桑葚多糖單糖組成HPLC圖譜Fig.2-5 High Performance Liquid Chromatography of Monosaccharide Composition ofMulberry Polysaccharide注：A:混合單糖標(biāo)準(zhǔn)品；B: MFPs-70-1；C:MFPs-70-2；D: MFPs-90-1；E:MFPs-90-2。Note：A: Mixed monosaccharide standard; B: MFPs-70-1; C: MFPs-70-2; D: MFPs-90-1; E:MFPs-90-2.表2-3 桑葚多糖單糖組成Table2-3 Monosaccharide composition of the MFPs組分單糖組成（%）甘露糖 鼠李糖 半乳糖醛酸 葡萄糖醛酸 葡萄糖 木糖 阿拉伯糖MFPs-70-1 11.0 5.4 4.7 0 33.5 45.5 0MFPs-90-1 7.2 1.4 0 0 28.6 62.8 0MFPs-70-2 18.8 4.6 6.2 1.5 34.7 25.5 8.7MFPs-90-2 5.8 15.4 3.0 2.9 36.5 21.2 15.12.4.5 桑葚多糖的紅外光譜通過紅外光譜掃描譜圖（圖 2-6）可知：4 組桑葚多糖在 3400 cm-1、2900 cm-1附近均出現(xiàn)較強(qiáng)的寬吸收峰，這是糖類的特征吸收峰 O-H、不對(duì)稱 C-H 的振動(dòng)信號(hào)；同時(shí)在 1500~1400 cm-1左右出現(xiàn)吸收峰，這是非對(duì)稱及對(duì)稱-COO-振動(dòng)信號(hào)；此外在 1000 cm-1左右還出現(xiàn)吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)信號(hào)，說明 MFPs-70-1、MFPs-90-1、MFPs-70-2、MFPs-90-2 均是含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的桑葚多糖。在 1500~1400 cm-1，MFPs-70-2、MFPs-90-2 顯示出比更強(qiáng)的信號(hào)，證實(shí)了這兩組分多糖屬酸性多糖，并在 870 cm-1處還有額外的 β-糖苷鍵信號(hào)，說明 MFPs-70-2、MFPs-90-2 中含有β-糖苷鍵。DE

貴州師范大學(xué)碩士研究生35圖2-6 桑葚多糖的紅外光譜Fig.2-6 Infrared spectra of MFPs注：A:MFPs -70-1；B: MFPs-70-2；C :MFPs-90-1；D:MFPs-90-2。Note：A:MFPs -70-1; B: MFPs-70-2; C :MFPs-90-1; D:MFPs-90-2.2.5 小結(jié)（1）本章通過對(duì)桑葚干品的粉碎、除脂、熱水浸提、分級(jí)醇沉、脫蛋白得到兩組 MFPs-70 和 MFPs-90 桑葚粗多糖，并經(jīng)過 DEAE-52 纖維素柱和Sephadex G-100 凝膠柱分離純化，得到相對(duì)均一的 4 種桑葚多糖 MFPs-70-1、MFPs-70-2、MFPs-90-1、MFPs-90-2。（2）MFPs-70-1 是 70%醇沉桑葚多糖經(jīng)蒸餾水洗脫得到的含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的中性桑葚多糖，其總糖含量 87.64%，蛋白質(zhì)含量 1.29%，糖醛酸含量 6.26%；主要由甘露糖 11.0%、鼠李糖 5.4%、半乳糖醛酸 4.7%、葡萄糖 33.5%和木糖45.5%組成，分子量為 316 kDa，。（3）MFPs-90-1 是 90%醇沉桑葚多糖經(jīng)蒸餾水洗脫得到的含有吡喃環(huán)結(jié)構(gòu)的中性桑葚多糖

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2 譚西;桑葚多糖低濃度乙醇分級(jí)純化、分子修飾及抗急性酒精性肝損傷活性研究[D];貴州師范大學(xué);2019年

3 方舒;駱駝尿液對(duì)小鼠急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究[D];內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué);2019年

4 丁運(yùn)文;解酒護(hù)肝飲解酒及對(duì)急慢酒精性肝損傷保護(hù)作用的研究[D];上海交通大學(xué);2018年

5 張鈴浩;枸杞多糖對(duì)酒精性肝損傷的保護(hù)作用及機(jī)制研究[D];蘭州大學(xué);2019年

6 席浩;乳源六肽PGPIPN預(yù)防和降低急性酒精性肝損傷及其機(jī)制的實(shí)驗(yàn)研究[D];安徽醫(yī)科大學(xué);2019年

7 丁榮榮;殼寡糖對(duì)急性酒精性肝損傷的保護(hù)作用研究[D];江南大學(xué);2019年

8 柴博文;營(yíng)養(yǎng)素復(fù)合物對(duì)酒精性肝損傷大鼠的輔助保護(hù)作用[D];吉林大學(xué);2019年

9 宋影;基于CRISPR/Cas9技術(shù)研究Gp96在小鼠急性酒精性肝損傷中的作用[D];河南科技大學(xué);2019年

10 郝玉潔;諾麗果控溫發(fā)酵過程的研究及產(chǎn)物對(duì)急性酒精性肝損傷的預(yù)防[D];江南大學(xué);2018年

本文編號(hào)：2776653