發(fā)布時(shí)間：2020-07-24 15:27

【摘要】：近年來(lái),人們開始關(guān)注炎癥和腫瘤的關(guān)系,慢性炎癥往往和腫瘤的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)。許多因素(如化學(xué)刺激、病毒感染、自身免疫損傷等)均可引起機(jī)體產(chǎn)生不同程度的慢性炎癥。炎癥會(huì)導(dǎo)致正常細(xì)胞DNA損傷、基因組不穩(wěn)定、原癌基因突變、癌癥細(xì)胞的浸潤(rùn)、遷移等。因此,抗炎療法在癌癥的預(yù)防和治療中必不可少。目前臨床上使用的甾體和非甾體抗炎藥,在緩解炎癥的同時(shí)存在極大的副作用。中藥具有抗氧化、抑菌殺菌、降低血中及臟器中的內(nèi)毒素水平等作用,在炎癥的治療過(guò)程中起到免疫干預(yù)作用。中西醫(yī)結(jié)合作為一種新的治療手段,有廣闊的治療前景。銀杏作為中國(guó)的傳統(tǒng)藥物,在治療疾病方面有上千年的歷史。其中銀杏酚C17:1(Ginkgol C17:1)是銀杏酚單體之一,研究證實(shí)銀杏酚C17:1有較高的抗瘤活性,但有關(guān)于其抗炎及作用機(jī)制尚未報(bào)道。近年來(lái)有許多研究表明自噬參與炎癥性疾病。自噬直接抑制促炎復(fù)合物,并間接地清除受損細(xì)胞器或細(xì)胞內(nèi)病原微生物。本文主要使用脂多糖(LPS)誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞作為炎癥模型,通過(guò)觀察炎性因子指標(biāo)、氧化應(yīng)激指標(biāo)及自噬指標(biāo)的變化,旨在從自噬方面闡述銀杏酚C17:1對(duì)炎癥的保護(hù)作用,為臨床治療炎癥和拓展銀杏酚的藥理學(xué)作用提供理論依據(jù)。本實(shí)驗(yàn)的研究方法和內(nèi)容:(1)應(yīng)用MTT法檢測(cè)銀杏酚C17:1對(duì)巨噬細(xì)胞活性的影響。(2)應(yīng)用酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)巨噬細(xì)胞上清液中炎癥因子IL-6和TNF-α的濃度,確定LPS的最佳作用濃度和時(shí)間,建立細(xì)胞炎癥模型。(3)應(yīng)用實(shí)時(shí)定量PCR(quantitative reverse transcription PCR,q RT-pcr)和酶聯(lián)免疫吸附實(shí)驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)炎癥因子IL-6和TNF-α的m RNA相對(duì)表達(dá)量和在細(xì)胞上清液中的含量;應(yīng)用Western Blot檢測(cè)炎癥小體NLRP3和IL-1β的蛋白表達(dá)量,分析銀杏酚C17:1對(duì)炎癥小體和炎癥因子的影響。(4)熒光顯微鏡觀察銀杏酚C17:1對(duì)脂多糖刺激的巨噬細(xì)胞表達(dá)活性氧(ROS)的影響。(5)應(yīng)用Western Blot檢測(cè)脂多糖刺激后巨噬細(xì)胞TLR4、My D88、NF-κB、Phos NF-κB、ERK、Phos-ERK、STAT3、Phos-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量,分析銀杏酚C17:1對(duì)TLR4信號(hào)通路的影響。(6)應(yīng)用Western Blot檢測(cè)銀杏酚C17:1對(duì)脂多糖刺激后巨噬細(xì)胞表達(dá)自噬相關(guān)蛋白(Beclin1、LC3、P62)的影響。使用雙標(biāo)腺病毒RFP-GFP-LC3感染的細(xì)胞檢測(cè)銀杏酚C17:1作用巨噬細(xì)胞自噬流的變化。(7)加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,觀察自噬相關(guān)蛋白(LC3、P62)的表達(dá)情況。應(yīng)用q RT-PCR再次檢測(cè)炎癥因子IL-6和TNF-α的m RNA表達(dá)量,明確自噬在銀杏酚C17:1抑制炎癥反應(yīng)中的作用。研究結(jié)果:(1)MTT結(jié)果表明濃度在0-80μg/ml范圍內(nèi)的銀杏酚C17:1作用24 h對(duì)巨噬細(xì)胞的活性無(wú)明顯影響。(2)ELISA結(jié)果表明LPS最佳作用濃度是100 ng/ml,最佳作用時(shí)間是12 h。(3)100 ng/ml的LPS誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞12 h后,用40μg/ml的銀杏酚C17:1處理24 h可降低炎癥因子IL-6和TNF-α的m RNA水平以及在細(xì)胞上清中的相對(duì)表達(dá)量(P0.01 vs LPS);Western blot結(jié)果表明銀杏酚C17:1可呈劑量依賴性抑制炎癥小體NLRP3和IL-1β的蛋白表達(dá)水平。提示銀杏酚C17:1對(duì)LPS誘導(dǎo)后巨噬細(xì)胞分泌的炎性因子有抑制作用。(4)熒光顯微鏡觀察到銀杏酚C17:1抑制LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中ROS的產(chǎn)生(P0.01 vs LPS),說(shuō)明銀杏酚C17:1干擾巨噬細(xì)胞自由基分泌功能。(5)Western blot結(jié)果表明LPS可以激活巨噬細(xì)胞的TLR4及下游蛋白。銀杏酚C17:1可呈劑量依賴性降低TLR4、My D88、NF-κB、Phos NF-κB、ERK、Phos-ERK、STAT3、Phos-STAT3蛋白的相對(duì)表達(dá)量(P0.01 vs LPS),提示在LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞中,抑制TLR4、NF-κB/ERK、STAT3等信號(hào)通路可抑制炎性因子的分泌。(6)Western blot結(jié)果表明LPS刺激巨噬細(xì)胞后,自噬相關(guān)蛋白(Beclin1、LC3)的表達(dá)稍低于空白組,自噬下游蛋白P62顯著增加;而加入不同濃度銀杏酚C17:1后,自噬相關(guān)蛋白(Beclin1、LC3)表達(dá)增加,P62降低,且呈濃度依賴性;同樣,免疫熒光結(jié)果顯示,加入銀杏酚C17:1作用細(xì)胞后,自噬特異性蛋白LC3顆粒聚集增多,說(shuō)明銀杏酚C17:1可以誘導(dǎo)炎性狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬。(7)加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,自噬相關(guān)蛋白LC3Ⅱ減少,P62堆積。實(shí)時(shí)定量PCR結(jié)果顯示加入自噬抑制劑3-甲基腺嘌呤(3-MA)后,炎癥因子IL-6和TNF-α的m RNA表達(dá)量增加(P0.01 vs control)。提示LPS刺激后會(huì)減弱巨噬細(xì)胞的自噬能力,而銀杏酚C17:1會(huì)誘導(dǎo)炎癥狀態(tài)下的巨噬細(xì)胞發(fā)生自噬,且比基礎(chǔ)表達(dá)自噬水平更高。抑制自噬后,炎癥因子表達(dá)增加,進(jìn)一步說(shuō)明自噬在銀杏酚C17:1發(fā)揮抗炎過(guò)程中起到重要作用。結(jié)論:LPS誘導(dǎo)的炎癥反應(yīng)激活了巨噬細(xì)胞的TLR4信號(hào)通路,并抑制細(xì)胞自噬,而炎癥狀態(tài)下,銀杏酚C17:1可以抑制TLR4信號(hào)通路,提高巨噬細(xì)胞的自噬功能,對(duì)抗細(xì)胞的炎性反應(yīng),此抑炎作用可能與銀杏酚C17:1通過(guò)抑制TLR4、NF-κB/ERK、STAT3等信號(hào)通路及上調(diào)細(xì)胞自噬相關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：江蘇大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

巨噬細(xì)胞是構(gòu)成先天免疫、體內(nèi)平衡和其他炎癥性疾病的關(guān)鍵組成部分。除了吞噬、免疫調(diào)節(jié)、提呈抗原等作用外，它還可以分泌細(xì)胞因子。巨噬細(xì)胞在活化后有兩種不同的表型，即經(jīng)典活化的巨噬細(xì)胞(稱為 M1 表型)和交替活化的巨噬細(xì)胞（稱為 M2 表型）[12, 15]。M1 型巨噬細(xì)胞一般通過(guò) IFN-γ和細(xì)菌脂多糖 LPS活化，其特征是產(chǎn)生促炎性細(xì)胞因子（IL-1β、IL-6 和 TNF-α等），而 M2 表型參與抗炎性細(xì)胞因子（IL-4 和 IL-10）的分泌和組織修復(fù)[16, 17]。巨噬細(xì)胞可能通過(guò)極化為 M2 表型，發(fā)展成免疫抑制狀態(tài)，參與炎癥反應(yīng)。Porta 及其同事發(fā)現(xiàn)LPS 耐受的巨噬細(xì)胞與 M2 巨噬細(xì)胞具有相同的特征[18]。不同類型的巨噬細(xì)胞對(duì)組織微環(huán)境的作用不同，參與和貫穿炎癥性疾病的不同過(guò)程[19]。交替活化的巨噬細(xì)胞分泌抗炎介質(zhì)，并通過(guò)多條信號(hào)途徑包括 STATS、干擾素調(diào)節(jié)因子（IRFs）、NF-κB、AP1 和 PPARγ調(diào)節(jié)許多炎癥性疾病發(fā)展過(guò)程中的免疫應(yīng)答[20]。將巨噬細(xì)胞轉(zhuǎn)化為適當(dāng)?shù)谋硇驼{(diào)節(jié)各種炎性疾病，將是未來(lái)臨床治療炎癥的一個(gè)研究熱點(diǎn)。

圖 1.2 銀杏酚酸的結(jié)構(gòu)Fig 1.2 Structures of ginkgolic acids (A) ginkgols (B) and bilobol (C)（a） 銀杏酸(ginkgolic acids)（b）銀杏酚(ginkgols)和（c）白果二酚(bilobol)有研究表明銀杏酸易脫羧從而形成銀杏酚類物質(zhì)，銀杏酚比銀杏酸的結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，生物活性更強(qiáng)。銀杏酚由四種同系物單體組成：C13：0，C15：0，C11 和 C17：1，它們的主要區(qū)別在于烷基側(cè)鏈的長(zhǎng)度不同[30]。其中，Ginkgol C11 單體抑制腫瘤細(xì)胞活性的效果最為突出[31]。1.2.2 銀杏酚的分離和純化銀杏提取物包含很多物質(zhì)，已經(jīng)分離純化出的幾種物質(zhì)中只有少數(shù)有明確藥理作用，其它的物質(zhì)藥效不明確,甚至可能具有致敏作用。銀杏酸也具有皮致敏作用及細(xì)胞毒性，因此要求銀杏制劑中銀杏葉提取物中的含量須在 5×10

圖 1.3 自噬相關(guān)蛋白和自噬過(guò)程[48]Figure 1.3 Autophagy-associated protein complexes and autophagy process注：自噬過(guò)程包含至少四個(gè)主要階段，由 30 多種自噬相關(guān)（Atg）蛋白控制，并由兩種泛素樣結(jié)合系統(tǒng)介導(dǎo)，Atg12-Atg5 和 Atg8 / LC3：包括膜的啟動(dòng)，囊泡擴(kuò)張、成熟和融合，以及溶酶體內(nèi)膜及其內(nèi)容物的最終降解。1.3.3 自噬與炎癥的關(guān)系我們的研究重點(diǎn)討論巨自噬（以下簡(jiǎn)稱自噬），它與人類健康和疾病的關(guān)系也十分密切。自噬的基礎(chǔ)組成水平通過(guò)消除受損/舊細(xì)胞器以及長(zhǎng)壽命蛋白質(zhì)和蛋白質(zhì)聚集體的轉(zhuǎn)換在細(xì)胞穩(wěn)態(tài)中起重要作用，從而維持基本細(xì)胞組分的質(zhì)量控制。另一方面，當(dāng)細(xì)胞處于不良環(huán)境下，如缺乏營(yíng)養(yǎng)、病原體感染、氧化應(yīng)激、輻射或抗癌藥物治療，自噬可作為細(xì)胞的保護(hù)反應(yīng)顯著增加，從而導(dǎo)致適應(yīng)和存活；然而，自噬失調(diào)或過(guò)度活化可能會(huì)導(dǎo)致細(xì)胞死亡。因此，有缺陷的自噬不僅與多種疾病相關(guān)，也和衰老有關(guān)[49]。自噬缺陷還會(huì)影響抗原肽的傳遞，形成慢性

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前4條

1 馬懿;吳賽珠;龔勛;彭文杰;湯敏;湯展;鐘元林;;自噬與免疫相關(guān)性自噬的研究進(jìn)展[J];細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志;2014年09期

2 馬泰;孫國(guó)平;李家斌;;細(xì)胞自噬的研究方法[J];生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展;2012年03期

3 于耕紅;范昕;馮詠梅;;潰瘍性結(jié)腸炎患者CA125及內(nèi)毒素檢測(cè)價(jià)值的探討[J];臨床和實(shí)驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志;2011年11期

4 譚衛(wèi)紅,沈兆邦,王成章,郁青;銀杏葉中烷基酚化合物的分離與鑒定[J];林產(chǎn)化學(xué)與工業(yè);2001年04期

本文編號(hào)：2769033