【摘要】：研究背景增生性瘢痕(Hypertrophic scars,HS)是一種臨床常見但治愈率低的皮膚纖維化疾病,目前以手術(shù)和藥物注射治療為主。HS手術(shù)治療復發(fā)率較高,會給患者帶來痛楚,激素類藥物注射給藥副作用較大且費用相對昂貴。因此,研制出有效預防與治療HS的潛在新型藥物具有重要意義。人皮膚成纖維細胞(Human Skin Fibroblasts,HSF)是HS形成的關(guān)鍵效應細胞。研究認為HSF過度增殖、活化和分化成肌成纖維細胞(Human Myofibroblasts,HMF),是HS病理生理學的中心環(huán)節(jié)。丹酚酸B(Salvianolic acid B,SAB)具有明顯的抗纖維化作用,能抑制成纖維細胞增殖及膠原合成,作用于TGF-β/Smads等多個信號轉(zhuǎn)導通路。穿膜肽TAT是一種新型促進藥物轉(zhuǎn)運的佐劑,具有高度細胞穿透能力,能轉(zhuǎn)運藥物透過皮膚,促進藥物跨膜轉(zhuǎn)運而不改變轉(zhuǎn)導物質(zhì)生物活性或造成細胞膜傷害。本課題擬將合成的DSPE-PEG_(1000)-TAT作為導向性材料,制備載丹酚酸B的穿膜肽TAT修飾脂質(zhì)體(SAB-TAT-LIP)透皮制劑,使脂質(zhì)體具有高效的入胞能力,高效透過皮膚角質(zhì)層屏障,增強真皮層的藥物遞送和細胞攝取,從而發(fā)揮防治HS的作用。目的研制SAB-TAT-LIP透皮制劑,優(yōu)化制備工藝,進行質(zhì)量考察;考察其體外透皮性能、真皮層滯留效應及皮膚刺激性和致敏性;同時,考察其對體外HSF的增殖、遷移、侵襲、TGF-β_1表達水平、細胞周期與凋亡等生物學特性的影響,為SAB透皮給藥系統(tǒng)的研究提供新的思路和方法。方法(1)DSPE-PEG_(1000)-TAT磷脂導向性材料的合成與表征。將DSPE-PEG_(1000)-MAL和末端含有半胱氨酸的穿膜肽TAT通過邁克爾加成法合成DSPE-PEG_(1000)-TAT,采用MALDI-TOF-MS法對終產(chǎn)物進行分子量鑒定,FT-IR和~1H-NMR法進行結(jié)構(gòu)鑒定。(2)SAB-TAT-LIP的制備工藝研究。建立SAB的HPLC含量測定方法;以DSPE-PEG_(1000)-TAT作為磷脂導向性材料,采用pH梯度-逆向蒸發(fā)法制備SAB-TAT-LIP,以包封率為評價指標,單因素試驗篩選出顯著因素,在此基礎(chǔ)上采用Box-Behnken響應面法優(yōu)化脂質(zhì)體的制備工藝,并進行最優(yōu)工藝的驗證。(3)SAB-TAT-LIP的質(zhì)量評價。考察脂質(zhì)體形態(tài),粒徑,Zeta電位,載藥量,初步穩(wěn)定性和凍干穩(wěn)定性等理化性質(zhì);采用動態(tài)透析法考察脂質(zhì)體的體外釋藥規(guī)律;采用改良Franz擴散池法考察脂質(zhì)體的體外透皮性能,真皮層滯留效應,并繪制體外滲透曲線,擬合藥物動力學方程;進行皮膚刺激性和致敏性考察,觀察皮膚有無紅斑及水腫現(xiàn)象,同時將給藥部位的皮膚組織進行HE染色,綜合評價該脂質(zhì)體透皮制劑的安全性。(4)SAB-TAT-LIP對HSF增殖等細胞生物學特性的影響。建立HSF傳代培養(yǎng)、凍存和復蘇方法;考察SAB-TAT-LIP的體外血清穩(wěn)定性,并采用MTT比色法考察不同濃度SAB-TAT-LIP對HSF增殖活性的影響,設(shè)計合理的給藥濃度;采用Transwell小室法和劃痕法考察脂質(zhì)體對細胞侵襲和遷移能力的影響;采用流式細胞術(shù)考察脂質(zhì)體對細胞凋亡和細胞周期的影響;采用雙抗體夾心酶聯(lián)免疫吸附ELISA試驗檢測脂質(zhì)體對TGF-β_1表達水平的影響。結(jié)果(1)對比反應物和終產(chǎn)物的MALDI-TOF-MS、FT-IR和~1H-NMR圖譜,結(jié)果驗證所得的終產(chǎn)物為目標化合物,成功合成了DSPE-PEG_(1000)-TAT磷脂材料,可用于下一步實驗。(2)SAB-TAT-LIP最優(yōu)制備工藝為:取處方量的S100,Chol,DSPE-PEG_(1000),DSPE-PEG_(2000),DSPE-PEG_(1000)-TAT(100:33.33:2:1:1,mol/mol)溶于有機溶劑(氯仿:甲醇=2:1,v/v),SAB溶于1%甘氨酸-鹽酸緩沖鹽溶液(pH值為3.28),將兩相體系轉(zhuǎn)移入茄形瓶中,置于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中旋干有機溶劑,在氮氣氛圍下放置過夜吹干殘留的有機溶劑,加入適量的PBS緩沖鹽溶液調(diào)至pH值為6.0,繼續(xù)孵育30 min形成脂質(zhì)體乳液,探頭超聲180次(功率300 W,超1 s間隔1s),過0.8μm的微孔濾膜,然后用400 nm脂質(zhì)體擠出儀來回擠出15次整粒,即得SAB-TAT-LIP。測得該脂質(zhì)體載藥量為(6.31±0.34)mg·mL~(-1),包封率為(86.70±0.85)%。處方量擴大5倍后,測得載藥量為(6.27±0.51)mg·mL~(-1),包封率為(86.22±0.97)%。結(jié)果表明制備工藝穩(wěn)定可靠。(3)SAB-TAT-LIP大小較均勻,呈球狀或近球狀,分散性較好,平均粒徑為(219.90±5.09)nm,Zeta電位(-9.25±0.92)mV,多分散系數(shù)PDI值為0.190±0.013,4℃放置10 d穩(wěn)定性良好;脂質(zhì)體凍干粉復溶后形態(tài)和包封率無明顯變化,分布均勻,粒度圓整;體外24 h累積釋放率為62.49%,無突釋效應,具有明顯的緩釋作用,符合Hixon-crowell方程模型;體外32 h皮膚累積透過率為17.21%,透過速率為(28.33±4.9)μg?cm~(-2)?h~(-1),真皮層滯留量為(44.39±6.87)μg?cm~(-2),符合零級方程及Hixon-crowell方程模型,體外透皮性能明顯優(yōu)于SAB溶液和SAB普通脂質(zhì)體,且無皮膚刺激性和致敏性。(4)體外培養(yǎng)的HSF生長狀況良好,符合實驗要求;SAB-TAT-LIP在血清環(huán)境中24 h內(nèi)無明顯聚集和沉淀現(xiàn)象,粒徑大小和吸光度值無明顯變化,穩(wěn)定性較好;空白脂質(zhì)體對HSF基本無毒副作用,不同濃度的SAB-TAT-LIP干預HSF不同時間后,均具有一定的增殖抑制作用,且呈現(xiàn)劑量和時間依賴性,同時細胞遷移和侵襲能力明顯降低;SAB-TAT-LIP干預HSF 48 h后,可使細胞周期阻滯于G_0/G_1期,細胞早調(diào)和中晚調(diào)率明顯增加,TGF-β_1分泌量顯著降低,與空白對照組相比,差異具有統(tǒng)計學意義。結(jié)論Box-Behnken效應面法優(yōu)化得到的SAB-TAT-LIP包封率較高、粒徑較小,體外釋放和透皮行為均滿足局部透皮給藥制劑的體外釋放和透皮規(guī)律,對體外HSF的增殖、遷移和侵襲具有顯著的抑制作用,對細胞凋亡有促進作用,對細胞周期G_0/G_1期有阻滯作用,對TGF-β_1的表達水平有下調(diào)作用,為后期用于研究體內(nèi)防治HS及其作用機制奠定了基礎(chǔ)。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R283.6;R285.5
【圖文】：

growth factor,VEGF）[34]、成纖維細胞生長因子（Fibroblast growth factor, FGF[35]、肝細胞生長因子（Hepatocyte growth factor, HGF）[12]等，對 HS 的主要調(diào)作用見圖 1-2。這些生長因子在 HS 形成中通常會發(fā)揮雙重作用，且存在相互串聯(lián)和干擾現(xiàn)象，增大了信號轉(zhuǎn)導的復雜性。因此，靶向生長因子途徑治療 HS 時，應明確該生長因子在 HS 不同階段所起的確切作用。

圖 1-3 皮膚創(chuàng)面愈合中各種炎性細胞對 HSF 的作用[43]Fig.1-3 Effect of inflammatory cells on HSF in skin wound healing.1.4 ECM 代謝異常Ⅰ型與Ⅲ型膠原蛋白是正常皮膚組織中最主要的 ECM 成分，兩者的數(shù)量及

本研究針對 HS 表皮結(jié)締組織和角質(zhì)層明顯增厚，導致藥物滲透性差的關(guān)鍵問題入手，將中醫(yī)藥外治理論與新型微粒給藥系統(tǒng)相結(jié)合，研制具有良好透皮吸收性能的 TAT 修飾脂質(zhì)體，以期為 SAB 應用于 HS 的臨床治療提供新的思路和方便運用途徑，載丹酚酸 B 的穿膜肽 TAT 修飾脂質(zhì)體（SAB-TAT-LIP）防治 HS的研究思路見圖 1-4。

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本文編號：2767579