【摘要】：內(nèi)皮功能障礙是糖尿病血管疾病重要的病理基礎,而線粒體在維持內(nèi)皮細胞功能穩(wěn)定中扮演了不可或缺的角色。高糖(HG)可引起血管炎癥、氧化應激及線粒體功能障礙等,最終導致血管內(nèi)皮損傷。NF-κB通路在血管內(nèi)皮損傷發(fā)生和發(fā)展中起著極其重要的作用,沉默信息調節(jié)因子2相關酶1(SIRT1)具有改善血管內(nèi)皮功能障礙及延緩血管內(nèi)皮細胞衰老的作用。姜科山姜屬植物艷山姜(FAZ)是貴州省當?shù)氐拿耖g習用藥材,有研究表明其主要活性成分艷山姜揮發(fā)油(EOFAZ)對內(nèi)皮細胞損傷有保護作用,但其作用的具體機制尚不明確。目的:1.研究NF-κB在HG誘導人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)損傷過程中的作用,探討EOFAZ的保護作用。2.觀察EOFAZ調節(jié)HG誘導HUVECs線粒體損傷,尋找防治HUVECs損傷的有效作用靶點。3.觀察EOFAZ是否通過調控SIRT1/NF-κB通路而改善HUVECs線粒體損傷,進一步尋找防治內(nèi)皮細胞線粒體損傷的關鍵作用靶點及保護措施。方法:1.體外傳代培養(yǎng)HUVECs,取3-5代細胞用于實驗。蘇木素-伊紅(HE)染色及吉姆薩(Giemsa)染色后用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)學改變。四氮唑鹽比色法(MTT法)探索HG損傷HUVECs的最佳作用濃度及作用時間。建立HG誘導HUVECs損傷模型及EOFAZ預保護濃度梯度,并用檢測乳酸脫氫酶(LDH)外漏量實驗及MTT法驗證。實驗分對照組、HG組、HG+EOFAZ低劑量(EOFAZ濃度0.25μg/L)組、HG+EOFAZ中劑量(EOFAZ濃度1μg/L)組、HG+EOFAZ高劑量(EOFAZ濃度4μg/L)組、HG+吡咯烷二硫代氨基甲酸銨鹽(PDTC)組、甘露醇(Mannitol)組。各組細胞以劃痕實驗檢測細胞遷移能力。酶聯(lián)免疫吸附測定(ELISA)檢測白細胞介素-8(IL-8),腫瘤壞死因子-α(TNF-α)表達,Western-blotting法檢測血管細胞黏附分子-1(VCAM-1),血管細胞間黏附分子-1(ICAM-1),NF-κB p65,p-p65,IκBα蛋白表達水平。并用免疫熒光法進行NF-κB p65核轉位檢測。提取HUVECs核蛋白后檢測NF-κB p65 DNA結合活性。2.HUVECs分為對照組、HG組、HG+EOFAZ低劑量(EOFAZ濃度0.25μg/L)組、HG+EOFAZ中劑量(EOFAZ濃度1μg/L)組、HG+EOFAZ高劑量(EOFAZ濃度4μg/L)組、HG+環(huán)孢素A(Cyclosporin)組。各組細胞用ELISA法測定測定丙二醛(MDA),超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px),過氧化物酶體增殖活化受體γ輔助活化因子1α(PGC-1α),caspase-3、caspase-9的表達;采用熒光探針JC-1法檢測線粒體膜電位水平的變化,Western-blotting法檢測線粒體動力相關蛋白1(Drp1)、線粒體融合基因2(Mfn2)蛋白表達水平,并分別提取HUVECs胞漿蛋白及線粒體蛋白后檢測Bax蛋白的表達水平。流式細胞儀測定各組細胞凋亡及線粒體通透性轉換孔(MTPT)的開放情況;用熒光素-熒光素酶法檢測各組細胞的ATP含量。3.予優(yōu)化siRNA SIRT1轉染HUVECs的條件后,實驗分為對照組、HG組、siRNA SIRT1組、siRNA SIRT1陰性對照組、siRNA SIRT1+HG組、EOFAZ+HG(EOFAZ濃度4μg/L)組、EOFAZ+siRNA SIRT1(EOFAZ濃度4μg/L)組。Real-time PCR法測定siRNA對HUVECs SIRT1 mRNA表達的影響,以及用Western-blotting法測定SIRT1、caspase-3、Mfn2、Drp1、p65、p-p65、IκBα、乙酰化NF-κB p65蛋白表達;用檢測LDH外漏量測定反映細胞損傷情況;HUVECs線粒體可用MitoTracker Green熒光染料染為綠色,隨之使用熒光顯微鏡觀察各組細胞線粒體形態(tài)的變化;各組細胞用ELISA法測定TNF-α、IL-8、PGC-1α的表達;用熒光素-熒光素酶法檢測各組細胞的ATP含量。結果:1.傳代培養(yǎng)HUVECs,倒置顯微鏡觀察細胞融合形成單層后呈鋪路石狀排列。MTT法檢測確定EOFAZ(濃度為0.25-4μg/L)干預24 h后細胞活性沒有明顯改變(P0.05)。而HG最佳濃度為35mmol/L,最佳作用時間為24 h,此條件下HG誘導HUVECs存活率為68.7%±3.4%(P0.01),予濃度為0.25-4μg/L的EOFAZ預保護1 h后證實EOFAZ對HG誘導的HUVEC損傷呈現(xiàn)一定的劑量依賴保護作用。正式實驗選擇三個劑量的EOFAZ(0.25,1和4μg/L)來提供預保護。HG可顯著誘導HUVECs的LDH外漏增加(P0.01),與EOFAZ預孵育1 h可以明顯降低LDH外漏水平(P0.01);為了消除高滲性對HG誘導的LDH外漏的增加的影響,35mmol/L Mannitol孵育HUVECs對LDH外漏未見明顯影響(P0.05)。HUVECs經(jīng)HE染色后,可見對照組細胞核染成藍紫色,細胞飽滿,細胞質染成粉紅色。細胞呈鋪路石形狀,細胞之間排列緊密,形態(tài)比較均一;HG組細胞數(shù)目減少,細胞核居中,細胞間隙增大,周圍模糊,形態(tài)異于正常;EOFAZ組作用后細胞形態(tài)明顯較HG組規(guī)則,細胞間隙變小;HUVECs進行Giemsa染色后,可見對照組細胞核呈現(xiàn)為紫紅色,細胞漿呈現(xiàn)淡紅色。對照組的細胞核偏于一側、體積正常;HG組的細胞膨大,細胞核居中;相較于HG組,EOFAZ組及Mannitol組細胞融合呈鋪路石狀,形態(tài)規(guī)整均一,細胞之間排列較緊密。劃痕實驗表明相較對照組,HG作用后細胞遷移能力顯著下降(P0.01),而預先給予EOFAZ孵育1 h后,細胞遷移能力明顯增加(P0.01);EOFAZ干預可使HG誘導HUVECs炎癥因子TNF-α和IL-8的分泌顯著下調(P0.01)。加用NF-κB抑制劑PDTC干預后,可抑制HG誘導HUVECs ICAM-1和VCAM-1蛋白的表達(P0.01)。EOFAZ預處理HG誘導的HUVECs后,ICAM-1和VCAM-1蛋白水平顯著降低(P0.01)。HG處理后可以顯著降低p65和IκBα及增加p-p65蛋白水平(P0.01),EOFAZ預處理后均可顯著抑制上述變化(P0.01)。免疫熒光法進行核轉位檢測結果顯示HG可誘導HUVECs NF-κB p65由胞質移位進入細胞核,EOFAZ可以抑制HG誘導的NF-κB p65核移位;HG刺激可顯著增加NF-κB p65的DNA結合活性(P0.01),EOFAZ預處理1 h后NF-κB p65 DNA結合活性顯著降低(P0.01)。表明HG介導的NF-κB激活可被EOFAZ抑制,EOFAZ可能是通過抑制NF-κB激活起作用的。2.HG刺激HUVECs后MDA顯著增加(P0.01),而EOFAZ預保護可下調MDA的合成(P0.01)。MPTP抑制劑Cyclosporin也可顯著降低MDA的合成(P0.01)。采用和HG組同濃度的甘露醇干預排除滲透壓影響,和對照組比較未見明顯改變;HG處理HUVECs后SOD及GSH-Px顯著下降(P0.01),而EOFAZ組與HG組比較可上調GSH-Px合成,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),且顯著提高SOD的合成(P0.01)。采用和HG組同濃度的甘露醇干預排除滲透壓影響,和對照組比較未見明顯改變;同時Cyclosporin組較HG組也可顯著增加SOD及GSH-Px的含量(P0.01)。EOFAZ及Cyclosporin干預可使HG處理后的HUVECs JC-1綠色熒光翻轉至紅色,說明EOFAZ及Cyclosporin可增加HG誘導的線粒體膜電位水平下降;Western-blotting結果顯示與HG組比較,EOFAZ組及Cyclosporin組Drp1蛋白表達顯著減低(P0.01);且EOFAZ干預可上調Mfn2蛋白表達,差異有統(tǒng)計學意義(P0.05);HG組鈣黃綠素平均熒光強度明顯降低(P0.01),提示HG導致了HUVECs MPTP的持續(xù)開放,EOFAZ或Cyclosporin預處理可明顯提高HG處理后細胞內(nèi)鈣黃綠素的平均熒光強度(P0.01),提示EOFAZ有助于HG處理后細胞MPTP穩(wěn)定;HG干預后可顯著導致caspase-3及caspase-9活性增強(P0.01),而EOFAZ可不同程度抑制此作用。流式細胞儀檢測HUVECs凋亡程度,可見予HG作用后細胞凋亡率顯著增加(P0.01),而EOFAZ預保護1 h后可明顯使HG誘導的凋亡率下降(P0.01)。HG處理后HUVECs胞漿和線粒體Bax蛋白表達相較對照組均有所上調,但線粒體Bax蛋白表達上調的程度更為顯著(P0.01),證明大量的Bax蛋白從胞漿轉位至線粒體。在EOFAZ組及Cyclosporin組胞漿Bax和線粒體Bax蛋白表達相較HG組均下降。3.與對照組細胞相比較,當siRNA SIRT1濃度為30nmol/L時SIRT1 mRNA下降作用最為明顯(P0.01),因此隨后實驗選用30 nmol/L作為siRNA的轉染濃度。用Western blot檢測后發(fā)現(xiàn),與對照細胞組相比Si RNA SIRT1轉染后HUVECs SIRT1蛋白表達水平顯著下降(P0.01),caspase-3蛋白水平明顯上調(P0.01),而SiRNA陰性轉染組和對照組相比細胞SIRT1和caspase-3蛋白表達無顯著性差異(P0.05)。siRNA SIRT1轉染細胞后,LDH外漏率顯著高于對照組(P0.01),并且可顯著促進HG誘導的HUVECs LDH外漏(P0.01)。而EOFAZ預孵育1 h可以顯著減少siRNA SIRT1轉染誘導的LDH外漏(P0.01)。為了確定EOFAZ對siRNA SIRT1誘導的HUVECs炎癥因子表達的影響,使用ELISA測量TNF-α和IL-8的水平,siRNA SIRT1轉染細胞后TNF-α和IL-8的水平顯著高于對照組(P0.01),且可顯著促進HG誘導的HUVECs TNF-α和IL-8的水平(P0.01)。EOFAZ預孵育1 h可以顯著減少siRNA SIRT1轉染誘導的炎癥因子水平(P0.01)。Western blot及RT-PCR檢測顯示HG刺激可顯著抑制SIRT1 mRNA和蛋白的表達(P0.01),siRNA SIRT1轉染可使HG介導的SIRT1 mRNA和蛋白表達進一步下降(P0.01),采用EOFAZ預保護可使HG及siRNA SIRT1轉染誘導的SIRT1 mRNA和蛋白表達顯著增加(P0.01)。熒光顯微鏡顯示正常HUVECs中線粒體表現(xiàn)為典型的融合長條狀,而受損線粒體形態(tài)則轉變?yōu)榉稚⒌男A粒狀(fission),siRNA SIRT1刺激后可見含fission線粒體的細胞數(shù)量明顯增多(P0.01),EOFAZ預保護可使細胞fission線粒體數(shù)量明顯減少(P0.01)。si RNA SIRT1處理可顯著下調Mfn2蛋白并上調Drp1的表達(P0.01),且可使HG介導的Mfn2蛋白表達進一步下調,與HG組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),并使Drp1蛋白顯著上調(P0.01)。EOFAZ預處理可顯著上調siRNA SIRT1誘導的Mfn2表達下降(P0.01),且可顯著下調Drp1的表達(P0.01)。siRNA SIRT1轉染后顯著降低HUVECs ATP含量(P0.01),且可使HG介導的ATP含量進一步下降,與HG組比較差異有統(tǒng)計學意義(P0.05),而用EOFAZ干預后內(nèi)皮細胞ATP含量明顯升高,差異有統(tǒng)計學意義(P0.01)。siRNA SIRT1轉染后顯著降低HUVECs PGC-1α含量(P0.01),且可使HG介導的PGC-1α含量進一步下降(P0.01),予EOFAZ預孵育可顯著上調siRNA SIRT1引起的內(nèi)皮細胞PGC-1α含量下降(P0.01)。siRNA SIRT1可顯著上調HUVECs p65和IkBα蛋白表達,且顯著激活p65磷酸化即上調p-p65的表達(P0.01)。HG可使HUVECs乙�；疦F-κB p65蛋白表達顯著增加(P0.01),siRNA SIRT1組HUVECs NF-κB p65蛋白乙�；捷^HG組顯著上調(P0.01)。EOFAZ干預則可以顯著降低HG組及siRNA SIRT1組NF-κB p65蛋白乙�；�(P0.01)。結論:1.EOFAZ可以通過抑制NF-κB的激活改善HG誘導的HUVECs功能障礙。2.HG通過誘導MPTP開放、線粒體生物合成障礙及激活線粒體凋亡途徑導致HUVECs線粒體損傷,EOFAZ對HG誘導HUVECs線粒體功能障礙具有抑制作用。3.EOFAZ可上調SIRT1的表達,對siRNA SIRT1引起的HUVECs線粒體損傷具有抑制作用。下調SIRT1表達可以通過影響NF-κB p65蛋白乙�；郊せ頝F-κB通路,EOFAZ可以調控SIRT1/NF-κB通路改善HG引起的血管內(nèi)皮細胞功能障礙。EOFAZ作為SIRT1激活劑為尋找有效防治DM血管病變提供了新的藥物和思路。
【學位授予單位】：貴州醫(yī)科大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

倒置顯微鏡下HUVECs正常形態(tài)：100×Fig.1-1Normalmorphologyofhumanumbilicalveinendothelialcellswithinverted

貴州醫(yī)科大學 2018 屆科學學位博士研究生學位論文顯著降低高水平的 LDH 外漏（P<0.01）。為了消除高滲性對 HG 誘導的 LDH漏增加的影響，將 35mmol / L 甘露醇（Mannitol）替代 HG 處理細胞，可見 Mann對 LDH 外漏沒有影響，見圖 1-2D。

HE染色：100×Fig.1-3HEstaining：100×

【參考文獻】

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本文編號：2763602