【摘要】：目的:通過比較姜黃素、姜黃提取物的抗肝癌細胞活性,對比抗凝作用占優(yōu)勢的姜黃提取物與抗炎作用占優(yōu)勢的姜黃素兩者的抗肝癌Hep G2細胞增殖、侵襲作用差異,驗證活血化瘀中藥的抗炎-抗肝癌途徑作用機制。方法:(1)采用CCK8法,觀察梯度濃度姜黃提取物(CLE:171.5、343、686、1372μg/m L)、姜黃素(Cur:14.7、29.5、58.9、117.8μg/m L)作用于Hep G2細胞后細胞增殖能力,并由此計算此藥物的半數(shù)有效濃度(IC_(50)),將以抗凝作用為主的姜黃提取物中姜黃素含量8.59%換算,將姜黃提取物中的姜黃素1/2IC_(50)與姜黃素1/2IC_(50)對比其抑制率,并取1/2IC_(50)濃度作為后續(xù)實驗的工作液濃度。(2)將1/2IC_(50)質量濃度的姜黃提取物,與姜黃提取物中姜黃素含量換算后的等劑量姜黃素,在梯度濃度的LPS(0、3、6、12、24、48μg/m L)刺激誘導下采用CCK8法對比檢測對Hep G2細胞的增殖抑制率。初步判斷姜黃以抗炎-抗肝癌作用途徑還是以抗凝-抗肝癌作用途徑為主導作用?(3)凝血酶(Th)5U/m L刺激人臍靜脈血管內皮細胞(HUVECs)產生HUVECs釋放液,ELISA法檢測分成空白對照組、凝血酶組、凝血酶加LPS組HUVECs釋放液中組織型纖溶酶原激活物(t-PA)、纖溶酶原激活物抑制物(PAI-1)、IL-6的水平。(4)CCK8法檢測LPS誘導與HUVECs釋放液對Hep G2細胞的增殖能力影響的對比(5)CCK8法對比檢測姜黃提取物、姜黃素對HUVECs釋放液誘導下Hep G2細胞的增殖的影響(6)姜黃素與姜黃提取物對人肝癌Hep G2細胞的侵襲能力的對比研究(7)RT-PCR檢測IL-6、i NOS的基因表達變化。Western blotting方法檢測IL-6、i NOS的蛋白的表達變化。結果:(1)LPS對Hep G2細胞的增殖起促進作用呈一定的時間-劑量依賴性;LPS大于50μg/ml時,隨著濃度的增加和時間的延長,LPS對Hep G2細胞的增殖起抑制作用,因此LPS以50μg/ml作為誘導干預濃度。(2)姜黃提取物和姜黃素均可以抑制人肝癌Hep G2細胞的增殖(P0.05),并且呈一定的時間-劑量依賴性。經計算姜黃素IC_(50)(24 h)值為48.43μg/m L,在后續(xù)實驗中,確定姜黃素處理Hep G2細胞的工作質量濃度分別為24μg/m L和48μg/m L。姜黃提取物IC_(50)(24 h)值為663.1μg/m L,確定姜黃提取物處理Hep G2細胞的工作質量濃度分別為331.5μg/m L和663μg/m L。經計算姜黃提取物中的姜黃素的IC_(50)(24 h)值為56.93μg/m L,與姜黃素IC_(50)(24 h)值48.43μg/m L相當接近。說明姜黃提取物主要依靠姜黃素發(fā)揮抑制肝癌Hep G2細胞增殖作用。確定姜黃提取物中經含量換算后所含姜黃素對應的等量姜黃素,處理Hep G2細胞的工作質量濃度57μg/m L和28.5μg/m L。后續(xù)細胞遷移、侵襲能力及蛋白表達的影響實驗檢測均以姜黃提取物331.5μg/m L以及其中姜黃素含量換算對應等量姜黃素28.5μg/m L為對比工作濃度。(3)在LPS炎性誘導下,姜黃提取物以姜黃素對抗炎癥反應過程從而增加hep G2細胞增殖抑制率,而其中的抗凝成分對Hep G2增殖抑制率無明顯影響。(4)姜黃提取物中抗凝成分能有效拮抗凝血酶刺激釋放液中t-PA、PAI-1的釋放,姜黃提取物、姜黃素均具有抗凝、抗炎雙重作用,姜黃提取物以抗凝作用占優(yōu)勢,而姜黃素以抗炎作用占優(yōu)勢。(5)在HUVECs釋放液中t-PA、PAI-1、IL-6等因子作用下,人肝癌Hep G2細胞的增殖能力無顯著變化。姜黃素對肝癌Hep G2細胞的抑制作用略大于姜黃提取物。進一步說明姜黃的對Hep G2細胞的作用——姜黃提取物以抗凝作用占優(yōu)勢,而姜黃素以抗炎作用占優(yōu)勢。(6)無LPS干預組/LPS干預組的比值,與對照組比較,1/2IC_(50)及1/4IC_(50)姜黃提取物組經過LPS干預后均能使肝癌細胞穿過Matrigel基質膠的數(shù)目增加程度更高,侵襲能力明顯增強(P0.05)。331.5μg/m L姜黃提取物LPS干預組對肝癌細胞侵襲能力作用無明顯差異,(P0.05)。(7)1/2IC_(50)姜黃提取物處理Hep G2細胞24 h時,i NOS的m RNA表達均顯著下調,差異顯著(P0.05、0.01),且在炎性狀態(tài)下姜黃提取物組降低作用明顯優(yōu)于姜黃素組,兩組間比較差異顯著(P0.01)。當LPS處理24h后,LPS對Hep G2細胞的促炎作用顯著(P0.01)。對于LPS干預的炎性狀態(tài)下Hep G2細胞,姜黃提取物LPS干預組及姜黃素LPS干預組對其IL-6的表達有明顯抑制作用(P0.01),兩組抑制作用相當,無明顯差異(P0.05)。(8)Western blotting方法檢測i NOS蛋白的表達結果顯示,姜黃素及姜黃提取物對于LPS干預的炎性狀態(tài)下Hep G2細胞的i NOS蛋白水平均有抑制作用。其中姜黃提取物LPS干預組降低作用明顯強于姜黃素LPS干預組,兩組間比較差異顯著(P0.01)。檢測IL-6蛋白的表達結果顯示,對于LPS干預的炎性狀態(tài)下Hep G2細胞,姜黃提取物LPS干預組及姜黃素LPS干預組對其IL-6蛋白表達有明顯抑制作用(P0.05),兩組抑制作用無明顯差異(P0.05)。結論:1.姜黃素具有優(yōu)良的抗炎作用,主要通過抗炎途徑發(fā)揮抗肝癌效應。2.姜黃提取物具有優(yōu)良的抗凝作用,雖然能明顯拮抗t-PA、PAI-1等凝血因子,但對抗肝癌腫瘤細胞增殖、侵襲作用不明顯。3.姜黃素及姜黃提取物主要通過下調IL-6、i NOS的基因表達及蛋白水平發(fā)揮抗炎作用。且姜黃提取物下調i NOS的基因表達及蛋白水平程度更低,但其對抗肝癌腫瘤細胞增殖、侵襲作用不明顯。4.活血化瘀中藥姜黃發(fā)揮抗肝癌作用效應主要通過抗炎途徑,并非通過抗凝途徑。
【學位授予單位】：湖南中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

23表 1 姜 黃 素 及 姜 黃 提 取 物 對 HepG2 細 胞 iNOS 蛋 白 表 達 的 影 響 ( x±s, n = 3)注 ： 與 對 照 組 比 較 ：*P＜ 0.05**P＜ 0.01； 與 Cur 組 比 較 ：▲ ▲P＜ 0.01；與 Control+LPS 組 比 較 ：△P＜ 0.05△ △P＜ 0.01； 與 Cur+LPS 組 比 較 ：##P＜ 0.01。分組 Control Control+LPS Cur Cur+LPS CLE CLE+LPSiNOS 0.833±0.100 1.072±0.066* 0.617±0.076* 0.846±0.112△0.400±0.050▲▲** 0.541±0.053△

為ELISA臉測IL6水平，與對照組比較:*"P<0.01:與Th組比較:00P<0.01;圖6為ELISA}瀏t-PA水平，與對照組比較:*P<0.01;與Th組比較

23表 1 姜 黃 素 及 姜 黃 提 取 物 對 HepG2 細 胞 iNOS 蛋 白 表 達 的 影 響 ( x±s, n = 3)注 ： 與 對 照 組 比 較 ：*P＜ 0.05**P＜ 0.01； 與 Cur 組 比 較 ：▲ ▲P＜ 0.01；與 Control+LPS 組 比 較 ：△P＜ 0.05△ △P＜ 0.01； 與 Cur+LPS 組 比 較 ：##P＜ 0.01。分組 Control Control+LPS Cur Cur+LPS CLE CLE+LPSiNOS 0.833±0.100 1.072±0.066* 0.617±0.076* 0.846±0.112△0.400±0.050▲▲** 0.541±0.053△

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本文編號：2763491