【摘要】：1研究背景Atherosclerosis(As)是一種危害人類健康的疾病,許多危險(xiǎn)因素造成的血管內(nèi)皮損傷及功能障礙是As發(fā)生的關(guān)鍵。血流剪切力(Fluid shear stress,FSS)是血流與管壁摩擦產(chǎn)生的平行于管壁的切線應(yīng)力,FSS可保護(hù)血管內(nèi)皮功能,減輕血管內(nèi)皮炎癥。異常FSS如過(guò)低將導(dǎo)致血管內(nèi)皮功能紊亂,誘導(dǎo)血管內(nèi)皮炎癥,促進(jìn)As的發(fā)生。異常FSS的發(fā)生與中醫(yī)氣虛血瘀密切相關(guān)。至今尚無(wú)讓人十分滿意的阻止As進(jìn)展的西藥。目前,statins,外科手術(shù)及介入手術(shù)在臨床治療As有確切療效,但會(huì)伴有不同程度的副作用,研究指出statins能降低LDL-C的效果明顯,但其降低LDL-C的效果不具有線性量效聯(lián)系,劑量增加一倍,降低LDL-C水平的療效也只能增加6%,而肝毒性和肌病等副作用增加。因此,尋求治療As新方法很迫切。中醫(yī)理論與臨床實(shí)踐證明,氣虛血瘀是As的基本病因病機(jī)。益氣補(bǔ)血類中藥具有擴(kuò)張外周血管,增加器官血流量,改善血液濃,粘,凝,聚的作用。當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有補(bǔ)血,益氣的功效。我們前期研究結(jié)果表明當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有較好的內(nèi)皮保護(hù)作用,其機(jī)制主要是抑制內(nèi)皮炎癥發(fā)生,促進(jìn)內(nèi)皮祖細(xì)胞的功能加強(qiáng)內(nèi)皮修復(fù)。當(dāng)歸補(bǔ)血湯多靶點(diǎn)的內(nèi)皮保護(hù)途經(jīng)與生理性FSS抗As作用相似,因此在異常FSS環(huán)境中開(kāi)展當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管內(nèi)皮作用的研究,將為當(dāng)歸補(bǔ)血湯抗As研究供提供可靠的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。2研究目的通過(guò)研究當(dāng)歸補(bǔ)血湯在異常FSS環(huán)境中保護(hù)As血管內(nèi)皮損傷的藥效,探討當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血液流變學(xué),血脂,炎性因子的分泌和蛋白表達(dá)的影響,為當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療As提供了科學(xué)依據(jù)。3研究方法3.1異常FSS誘導(dǎo)As動(dòng)物模型的復(fù)制和評(píng)估新西蘭兔30只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后行右頸總動(dòng)脈套管術(shù),術(shù)后正常飼養(yǎng)2周。術(shù)前及術(shù)后2周末,全部動(dòng)物行右側(cè)頸總動(dòng)脈彩超探測(cè)及血液流變學(xué)檢測(cè)。計(jì)算FSS值,比較右側(cè)頸總動(dòng)脈術(shù)前及術(shù)后套管各節(jié)段剪切力FSS的大小,P0.05為差異有顯著性意義,異常FSS動(dòng)物造模成功。30只異常血流剪切應(yīng)力模型兔按體重隨機(jī)分為2組:普飼組(15只)喂予普通飼料,高脂組(15只)喂予2%高膽固醇飼料。每日投食2次,在第8,16周末,超聲探測(cè)兩組動(dòng)物右側(cè)頸總動(dòng)脈血流動(dòng)力學(xué),檢測(cè)血液流變學(xué),血脂及血管內(nèi)皮功能(血清ET-1),觀察動(dòng)物雙側(cè)頸總動(dòng)脈病理組織切片。以模型動(dòng)物低血流剪切應(yīng)力術(shù)區(qū)出現(xiàn)血管內(nèi)皮As病變來(lái)評(píng)估異常FSS誘導(dǎo)As模型復(fù)制的周期。3.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)異常FSS動(dòng)物模型動(dòng)脈As病變的作用及機(jī)制研究按黃芪當(dāng)歸5:1,3:1,1:1配伍比例稱取生藥,兩次煎,濃縮成含1g/mL生藥的水煎液。新西蘭兔120只,適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后,按體重隨機(jī)分為8組,每組15只。全部動(dòng)物麻醉后,假手術(shù)組不放套管,普通飼料喂養(yǎng),余動(dòng)物皆行右頸總動(dòng)脈套管術(shù),高脂喂養(yǎng)至第4周末,然后給藥如下:A假手術(shù)組:灌胃等量生理鹽水;B對(duì)照組:模型動(dòng)物灌胃等量生理鹽水;C中藥組(共5組):模型動(dòng)物灌胃當(dāng)歸補(bǔ)血湯;芪歸比例5:1高劑量(6g/kg)組,5:1中劑量(3g/kg)組,5:1低劑量(1.5g/kg)組;芪歸比例3:1(4g/kg)組和芪歸比例1:1(2g/kg)組;D阿托伐他汀(atorvastatin,AVT)組:模型動(dòng)物灌胃阿托伐他汀1.7 mg/kg;灌胃藥物劑量按人與動(dòng)物等效劑量折算,每天灌胃1次,給藥12周,日投食2次,日糧為體重的1.5%,每周測(cè)體重1次以調(diào)整給藥劑量,在第4周,16周末檢測(cè)相關(guān)指標(biāo):血流動(dòng)力學(xué)檢測(cè),頸總動(dòng)脈病理組織學(xué)觀察,血液流變學(xué),血脂,血清ET-1及NO檢測(cè),免疫組織熒光染色觀察頸總動(dòng)脈VCAM-1,LOX-1及NF-κBp65蛋白的表達(dá),兔外周血EPCs培養(yǎng)鑒定及功能檢測(cè)。3.3統(tǒng)計(jì)學(xué)分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)用SPSS22.0統(tǒng)計(jì)軟件處理,數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(X±s)表示,符合正態(tài)分布資料采用單因素方差分析(ANOVA)檢驗(yàn)。組間比較若方差齊時(shí)用LSD法,方差不齊時(shí)用Tamhane’s T2法。若為非正態(tài)分布資料采用Mann-Whitney U秩和檢驗(yàn),P0.05被認(rèn)為有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4研究結(jié)果4.1異常FSS誘導(dǎo)As動(dòng)物模型的復(fù)制和評(píng)估4.1.1兩組血流變學(xué)變化與普飼組相比,高脂組全血黏度明顯升高,血漿黏度變大,紅細(xì)胞變形指數(shù)降低,紅細(xì)胞變形性差,血液黏度越大。4.1.2兩組血清ET-1含量變化與普飼組相比高脂組兔血清ET-1明顯升高。4.1.3兩組血脂含量的變化與普飼組相比,高脂組血清TC,TG,LDL水平明顯升高(P0.05),HDL降低(P0.05)。4.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)異常FSS動(dòng)物模型動(dòng)脈As病變的作用及機(jī)制研究4.2.1血流剪切應(yīng)力的變化模型組與假手術(shù)組相比,舒張末期內(nèi)徑增大,收縮期峰值流速及舒張期血流速度明顯降低(P0.05)。用藥組與模型組相比,舒張末期內(nèi)徑無(wú)明顯變化,但無(wú)論是收縮期峰值流速還是舒張期血流速度都明顯加快(P0.05)。4.2.2總動(dòng)脈低剪切力區(qū)域血管HE染色結(jié)果與假手術(shù)組相比,模型組套管近心端血管可看到明顯的As斑塊,斑塊纖維帽形成,其下可見(jiàn)大量泡沫細(xì)胞及淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),纖維帽深部有大量膽固醇結(jié)晶及壞死物沉積,說(shuō)明模型造模成功,與模型組相比,用藥組僅3:1及1:1組有小部分As斑塊形成,AVT見(jiàn)內(nèi)膜的增厚,部分內(nèi)膜不平滑,內(nèi)皮細(xì)胞不完整有脫落現(xiàn)象,而5:1給藥組無(wú)粥樣斑塊形成,且內(nèi)膜完整。4.2.3血流變學(xué)結(jié)果與假手術(shù)組對(duì)比,模型組全血黏度明顯升高,血漿黏度同樣增大,紅細(xì)胞變形指數(shù)降低。而與模型組比較,用藥組全血黏度,血漿黏度都有不同程度的降低,其中芪歸5:1高劑量組與AVT組降低效果最明顯,芪歸5:1中劑量組次之,紅細(xì)胞變形指數(shù)只有芪歸5:1中劑量組與AVT組有明顯的升高(P0.05)。4.2.4血脂含量的變化與假手術(shù)組比較,模型組TC,TG,LDL-C均明顯升高,而HDL-C明顯減少(P0.05)。用藥組與模型組相比較,TC,TG,LDL-C均有不同程度的降低,其中芪歸5:1劑量組TC的含量最低,且高劑量組降低最明顯,HDL-C水平芪歸5:1中劑量組升高最明顯。另外,LDL-C的含量,只有芪歸5:1劑量組與模型組相比下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05),而芪歸3:1劑量組,1:1組與AVT組減少量與模型組相比無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2.5血清ET-1含量與假手術(shù)組相比較,模型組ET-1含量明顯上升(P0.05)。用藥組與模型組相比芪歸比例5:1組與AVT組ET-1含量明顯下降,其中高劑量組降低最明顯(P0.05)。而3:1與1:1組盡管血清ET-1含量降低,但其降低水平無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2.6血清NO含量統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn),各組血清NO結(jié)果相類似,無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。4.2.7血管組織ICAM-1檢測(cè)模型組與假手術(shù)組相比,血管組織ICAM-1含量明顯增加,兩者差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。而用藥組與模型組相比較,血管組織ICAM-1含量均明顯降低,差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.05)。4.2.8血管VCAM-1蛋白的表達(dá)結(jié)果模型組與假手術(shù)組比較,模型組血管組織VCAM-1熒光強(qiáng)度最大,VCAM-1在斑塊內(nèi)高表達(dá);用藥組與模型組相比,血管組織VCAM-1的熒光強(qiáng)度明顯弱于模型組;在用藥組中芪歸比例5:1組與AVT組熒光強(qiáng)度較弱,其中5:1高劑量組熒光強(qiáng)度最弱,證明VCAM-1表達(dá)量最少,而1:1劑量組在用藥組中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。4.2.9血管LOX-1蛋白的表達(dá)結(jié)果模型組與假手術(shù)組比較,血管組織LOX-1熒光強(qiáng)度最大,LOX-1在斑塊內(nèi)高表達(dá);用藥組與模型組相比,血管組織LOX-1的熒光強(qiáng)度明顯弱于模型組;在用藥組中芪歸比例5:1組熒光強(qiáng)度顯著降低,其中5:1高劑量組熒光強(qiáng)度最弱,證明LOX-1表達(dá)量最少,而1:1劑量組在用藥組中熒光強(qiáng)度最強(qiáng),AVT次之。4.2.10血管NF-κBp65蛋白的表達(dá)結(jié)果模型組與假手術(shù)組比較,模型組血管組織NF-κBp65蛋白熒光強(qiáng)度顯著,NF-κBp65蛋白在斑塊內(nèi)高表達(dá),用藥組與模型組相比,血管組織NF-κBp65蛋白的熒光強(qiáng)度明顯弱于模型組,在用藥組中芪歸比例5:1組與AVT組熒光強(qiáng)度較弱,其中AVT組熒光強(qiáng)度最弱,證明NF-κBp65蛋白表達(dá)量最少,而1:1劑量組在用藥組中熒光強(qiáng)度最強(qiáng)。4.2.11熒光染色鑒定EPCs第16周末,抽取兔外周血,分離培養(yǎng)EPCs,5-7天后,我們采用FITC-UEA-I,DiI-acLDL和DAPI分別對(duì)分離的細(xì)胞進(jìn)行染色,在熒光顯微鏡下觀察,顯示綠色熒光的為UEA-I陽(yáng)性細(xì)胞,紅色熒光的為DiI-acLDL陽(yáng)性細(xì)胞,藍(lán)色熒光則是細(xì)胞核,三染陽(yáng)性細(xì)胞為正在分化的EPCs。4.2.12當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)兔外周血EPCs功能的影響模型組與正常組相比較EPCs集落數(shù)減少,遷移力及成小管力降低(P0.05)用藥組與模型組除1:1用藥組外,其余各組EPCs集落增加,且EPCs遷移力及成小管力均有不同程度的增強(qiáng),5:1高劑量組與AVT組藥效作用最明顯,而1:1用藥組最差。5結(jié)論及討論5.1異常FSS誘導(dǎo)As動(dòng)物模型的復(fù)制和評(píng)估本研究采用單側(cè)頸總動(dòng)脈套管術(shù)建立異常FSS動(dòng)物模型。發(fā)現(xiàn)喂特制高脂飼料8周,16周后,普飼組及高脂組右側(cè)頸總動(dòng)脈均形成了粥樣硬化斑塊,且在近心端及低剪切應(yīng)力側(cè)斑塊最明顯,并隨時(shí)間延長(zhǎng)而加重,而左側(cè)頸總動(dòng)脈未出現(xiàn)粥樣硬化斑塊。由于本實(shí)驗(yàn)進(jìn)行了自身左側(cè)對(duì)照,具有很強(qiáng)的可比性,除了切應(yīng)力差異外,高脂組兩側(cè)頸總動(dòng)脈的其他條件(包括動(dòng)脈中的高脂血癥)都完全相同,因此可以把右側(cè)頸總動(dòng)脈粥樣硬化形成歸因于異常剪切應(yīng)力變化,且病理結(jié)果提示在近心端及低剪切應(yīng)力側(cè)斑塊最明顯,這與其他學(xué)者的研究報(bào)道是一致的,可得出以下結(jié)論:異常FSS可產(chǎn)生動(dòng)脈粥樣硬化病變,其中高脂合并低剪切力形成動(dòng)脈粥樣硬化斑塊最明顯。另外本研究還發(fā)現(xiàn),喂高脂飼料后第16周兔的血脂四項(xiàng)指標(biāo)即顯著聲高,血流剪切力與普飼組對(duì)比明顯降低,高脂喂養(yǎng)提高了全血黏度水平,升高了血清ET-1水平,提示高血脂癥對(duì)異常FSS模型的動(dòng)脈粥樣硬化有促進(jìn)和預(yù)示作用。5.2當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)異常FSS動(dòng)物模型動(dòng)脈As病變的作用及機(jī)制研究本實(shí)驗(yàn)通過(guò)建立異常FSS動(dòng)物模型動(dòng)脈粥樣硬化病變,以及使用不同芪歸比例的當(dāng)歸補(bǔ)血湯進(jìn)行藥物干預(yù),發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯能有效的改善低剪切應(yīng)力誘導(dǎo)的動(dòng)脈粥樣斑塊的形成。當(dāng)歸補(bǔ)血湯能夠有效調(diào)節(jié)血脂,改善血流變學(xué)變化,降低ET-1產(chǎn)生,提高血流速度,從而恢復(fù)低剪切應(yīng)力區(qū)域血流剪切應(yīng)力。另外當(dāng)歸補(bǔ)血湯有效抑制了ICAM-1,VCAM-1,LOX-1及NF-κB蛋白在低剪切應(yīng)力區(qū)域血管組織上的表達(dá)。通過(guò)分離提取給藥后的兔外周血內(nèi)皮祖細(xì)胞,我們還發(fā)現(xiàn)當(dāng)歸補(bǔ)血湯能有效改善EPCs功能。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明芪歸比例5:1組藥效最明顯,隨著芪歸比例的降低,藥效隨之下降。以上結(jié)果證明當(dāng)歸補(bǔ)血湯在異常剪切應(yīng)力環(huán)境中發(fā)揮抗As功能可能與其調(diào)節(jié)血脂,改善血流變學(xué)變化,提高血流量,保護(hù)EPCs及抗炎癥反應(yīng)的作用密切相關(guān),并且不同芪歸比例的藥效具有明顯的差別,其中芪歸比例5:1組藥效最明顯。6創(chuàng)新點(diǎn)首次探討了異常FSS環(huán)境中不同黃芪當(dāng)歸比例的當(dāng)歸補(bǔ)血湯對(duì)血管內(nèi)皮功能的保護(hù),拓展了生物力學(xué)結(jié)合中醫(yī)藥抗As研究的新思路。7不足與展望隨著現(xiàn)在各學(xué)科領(lǐng)域的快速發(fā)展,當(dāng)歸補(bǔ)血湯治療As的現(xiàn)代研究正在不斷汲取新的思路和技術(shù),由于本人能力有限,另外當(dāng)歸補(bǔ)血湯具有多靶點(diǎn)的內(nèi)皮保護(hù)途經(jīng),可能通過(guò)其他途徑發(fā)揮治療As作用,有待于進(jìn)一步深入研究。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285.5;R-332

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2758273