【摘要】：目的:探討淫羊藿次苷Ⅱ(icarisidⅡ,ICSⅡ)對大鼠皮層神經(jīng)元低氧性軸突損傷的保護(hù)作用及其機(jī)制,為臨床低氧性軸突損傷的治療提供實驗依據(jù)。方法:原代培養(yǎng)的新生SD大鼠皮層神經(jīng)元。為探索氧濃度和缺氧時間對神經(jīng)元軸突損傷的影響,將神經(jīng)元隨機(jī)分為正常組、5%低氧組、10%低氧組、15%低氧組。為探究ICSⅡ?qū)Φ脱跣暂S突損傷的保護(hù)作用及機(jī)制,將神經(jīng)元隨機(jī)分為正常組、10%低氧組、10%低氧+ICSⅡ3μM組、10%低氧+ICSⅡ6μM組、10%低氧+ICSⅡ9μM組、10%低氧+PI3K抑制劑組、10%低氧+ICSⅡ9μM+PI3K抑制劑組。于5%CO_2、37℃環(huán)境下進(jìn)行神經(jīng)元培養(yǎng),正常組為自然環(huán)境氧濃度,各低氧組使用N_2調(diào)節(jié)氧濃度,無菌密閉低氧箱中持續(xù)培養(yǎng)。除LY294002作用48h外,其余各組均分別培養(yǎng)24h、48h和72h。各PI3K抑制劑組均先予以PI3K抑制劑LY294002 20μM預(yù)處理1h后加入維持培養(yǎng)基或ICSⅡ。分別在各觀察時間點進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)測定:噻唑藍(lán)(MTT)法測定神經(jīng)元細(xì)胞活力,微量酶標(biāo)法檢測培養(yǎng)液上清中乳酸脫氫酶(LDH)活力,β-ⅢTubulin免疫熒光染色觀察軸突網(wǎng)絡(luò)形態(tài)學(xué)變化,并測量軸突變性指數(shù)(DI)及最長突起長度進(jìn)行量化分析。結(jié)果:(1)與正常組比較,低氧條件下培養(yǎng)的SD大鼠皮層神經(jīng)元折光性下降,胞體腫脹,軸突網(wǎng)絡(luò)逐漸崩解,軸突斷裂、縮短甚至消失。隨著氧濃度的降低,軸突損傷逐漸加重。與正常組比較,15%氧濃度時軸突網(wǎng)絡(luò)部分崩解,串珠形成,軸突斷裂、縮短,細(xì)胞存活率及培養(yǎng)上清液中LDH活力無顯著性改變(P0.05,P0.05);10%氧濃度時,24h、48h其軸突縮短明顯而神經(jīng)元存活率無明顯變化(P0.05,P0.05);72h其軸突網(wǎng)絡(luò)崩解,細(xì)胞存活率下降且培養(yǎng)上清液中LDH活力升高(P0.05,P0.05);5%氧濃度時軸突網(wǎng)絡(luò)完全崩解、甚至消失,細(xì)胞存活率下降且培養(yǎng)液上清中LDH活力升高(P0.05,P0.05)。(2)在10%氧濃度培養(yǎng)72h,與10%低氧組比較,ICSⅡ(3μM)組未見明顯的保護(hù)作用,中高ICSⅡ(6μM、9μM)組軸突明顯延長,細(xì)胞存活率上升,但仍低于正常組。PI3K抑制劑預(yù)處理后,與10%低氧組比較,ICSⅡ各組軸突無明顯改變(P0.05)。結(jié)論:(1)低氧狀態(tài)下,體外培養(yǎng)SD大鼠皮層神經(jīng)元發(fā)生軸突損傷,隨著缺氧時間延長及缺氧程度加重,逐漸出現(xiàn)胞體損傷,表明低氧條件下的軸突損傷早于細(xì)胞損傷。(2)在10%低氧條件ICSⅡ?qū)S突損傷有保護(hù)作用,這可能是通過激活PI3K信號通路發(fā)揮作用。
【學(xué)位授予單位】：遵義醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1 突起長度的測定方法 A: 神經(jīng)元倒置熒光顯微鏡拍照；B: 分析軟件手動描繪出突起的軌跡，測量最長突起的長度。1.4 統(tǒng)計學(xué)方法采用 SPSS23.0 軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，結(jié)果以x ±s 表示。多組間均數(shù)差異比較

圖 2 新生 SD 大鼠皮層神經(jīng)元 6 天（×200） 圖 3 新生 SD 大鼠皮層神經(jīng)元 7 天（×200）.1.2 皮層神經(jīng)元純度的鑒定通過免疫熒光染色進(jìn)行，如（圖 4）所示：神經(jīng)細(xì)胞的胞體和突起能被 β-ⅢTub標(biāo)記呈綠色；而所有細(xì)胞的細(xì)胞核可被 DAPI 標(biāo)記而呈藍(lán)色。通過計算 β-ⅢTub

細(xì)胞長勢和密度達(dá)到最佳狀態(tài)（見圖 2、圖3）。圖 2 新生 SD 大鼠皮層神經(jīng)元 6 天（×200） 圖 3 新生 SD 大鼠皮層神經(jīng)元 7 天（×200）2.1.2 皮層神經(jīng)元純度的鑒定通過免疫熒光染色進(jìn)行，如（圖 4）所示：神經(jīng)細(xì)胞的胞體和突起能被 β-ⅢTubulin所標(biāo)記呈綠色；而所有細(xì)胞的細(xì)胞核可被 DAPI 標(biāo)記而呈藍(lán)色。通過計算 β-ⅢTubulin所標(biāo)記細(xì)胞與所有細(xì)胞的比值，即得出該體系培養(yǎng)神經(jīng)元細(xì)胞的純度。通過計算得出本培養(yǎng)體系得出的神經(jīng)元細(xì)胞純度在 90%左右。β-Ⅲ Tubulin DAPI Merged圖 4 SD 大鼠乳鼠原代皮層神經(jīng)元鑒定（×400，比例尺：20μm）

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7 周q

本文編號：2758207