【摘要】：目的:本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,擬通過(guò)觀察斷藤益母湯對(duì)RAW264.7巨噬細(xì)胞誘導(dǎo)的破骨細(xì)胞分化、增殖及功能的影響,揭示斷藤益母湯抑制破骨細(xì)胞分化及其功能的分子機(jī)制,從而為臨床上應(yīng)用斷藤益母湯治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎提供實(shí)驗(yàn)依據(jù),并有助于進(jìn)一步推廣斷藤益母湯的應(yīng)用,讓更多的病人獲益。方法:實(shí)驗(yàn)一:建立RAW264.7巨噬細(xì)胞誘生破骨樣細(xì)胞模型,設(shè)立空白組,模型組,DTYMT400mg·L~(-1)、600mg·L~(-1)、800mg·L~(-1)、1000mg·L~(-1)濃度組和甲氨蝶呤2mg·L~(-1)組,制備斷藤益母湯凍干粉,并對(duì)各組進(jìn)行相應(yīng)干預(yù)。實(shí)驗(yàn)二:通過(guò)TRAP染色對(duì)破骨細(xì)胞進(jìn)行鑒定,探討斷藤益母湯對(duì)破骨細(xì)胞分化的影響。實(shí)驗(yàn)三:通過(guò)CCK-8法檢測(cè)各組細(xì)胞生存率,探討斷藤益母湯對(duì)破骨細(xì)胞增殖的影響。實(shí)驗(yàn)四:通過(guò)蛋白免疫印跡法檢測(cè)Wnt和RANKL信號(hào)通路關(guān)鍵蛋白表達(dá),探討斷藤益母湯對(duì)破骨細(xì)胞的分子通路作用機(jī)制。實(shí)驗(yàn)五:通過(guò)ELISA檢測(cè)MMP-9炎癥因子水平,探討斷藤益母湯對(duì)炎癥因子的影響。結(jié)果:實(shí)驗(yàn)一、二TRAP染色試驗(yàn)顯示,與模型組相比,DTYMT400mg·L-1、600mg·L-1濃度組的融合細(xì)胞數(shù)量有所減少,但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);DTYMT800mg·L-1、1000mg·L-1濃度組融合細(xì)胞數(shù)目顯著減少,具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P0.01),提示當(dāng)斷藤益母湯濃度達(dá)到一定水平后,可以有效抑制OC的分化。實(shí)驗(yàn)三CCK8結(jié)果顯示,與模型組比較,DTYMT600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1濃度組和甲氨蝶呤2mg·L-1組生存率明顯下降(P0.05,P0.01),提示一定濃度的斷藤益母湯可以明顯抑制OC的增殖。實(shí)驗(yàn)四免疫印跡結(jié)果顯示,與模型組相比,DTYMT1000mg·L-1組、甲氨蝶呤2mg·L-1組中RANKL蛋白表達(dá)量有所下降(P0.05)。DTYMT各組中的OPG蛋白表達(dá)水平無(wú)明顯上升或下降(P0.05);DTYMT800ug/ml、1000ug/ml濃度組、甲氨蝶呤2ug/ml組中Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)量顯著上升,DKK1蛋白表達(dá)水平顯著下降,提示一定濃度的DTYMT可以有效降低RANKL表達(dá)水平,增加Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)和下調(diào)DKK1表達(dá)。實(shí)驗(yàn)五ELISA結(jié)果顯示,與模型組相比,DTYMD600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1濃度組及甲氨蝶呤組中的MMP-9表達(dá)水平均有所下降,且DTYMT濃度越高,下降越明顯,提示DTYMT能顯著降低MMP-9的表達(dá)水平。結(jié)論:1.當(dāng)斷藤益母湯藥物濃度達(dá)到800ug/ml、1000ug/ml時(shí),可以有效抑制OC的分化。2.當(dāng)斷藤益母湯藥物濃度達(dá)到600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml時(shí),對(duì)破骨細(xì)胞的增殖具有抑制效果,且藥物濃度越高,抑制效果越明顯。3.當(dāng)斷藤益母湯藥物濃度達(dá)到800ug/ml、1000ug/ml時(shí),可以增加Wnt3a、β-catenin蛋白表達(dá)和下調(diào)DKK1表達(dá)。當(dāng)斷藤益母湯藥物濃度達(dá)到1000mg·L-1時(shí),可以有效降低RANKL表達(dá)水平。斷藤益母湯各濃度組對(duì)OPG蛋白的表達(dá)無(wú)明顯影響。4.斷藤益母湯藥物濃度達(dá)到600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1時(shí),能顯著降低MMP-9的表達(dá)水平。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

24注：***P<0.01圖2 每視野下平均陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。Figure 2. Average number of positive cells per field of view.4.3.2 斷藤益母湯對(duì)破骨細(xì)胞生存率的影響通過(guò)一般線性模型重復(fù)測(cè)量方差分析，得出組內(nèi)效應(yīng)檢驗(yàn)結(jié)果 F=5.11,P=0.015>0.05，說(shuō)明各組經(jīng)過(guò)不同的亞歐網(wǎng)濃度和干預(yù)時(shí)間之后，生存率存在差別，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。同時(shí)藥物濃度與干預(yù)時(shí)間存在交互效應(yīng)。組間檢驗(yàn)效應(yīng)結(jié)果顯示F=53.26，P=8.9063E-8<0.05，說(shuō)明不同的藥物濃度組之間，生存率具有差異，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。由圖 3 可知，模型組比較，DTYMT400mg L-1 組細(xì)胞生存率無(wú)明顯降低，；DTYMT600mg L-1、800mg L-1、1000mg L-1 濃度組和甲氨蝶呤 2mg L-1 組生存率均具有明顯下降，且與藥物濃度及干預(yù)時(shí)間相關(guān)，藥物濃度越高，干預(yù)時(shí)間越久，下降越明顯。

圖3.DTYMT對(duì)破骨細(xì)胞生存率影響Figure 3. Effect of DTMT on osteoclast survival4.3.3 斷藤益母湯對(duì) Wnt 通路和 RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響給藥干預(yù)細(xì)胞 24h 后，Wnt 通路和 RANKL 通路相關(guān)蛋白的表達(dá)條帶，如圖 17。對(duì)帶灰度行半定量分析，每個(gè)蛋白的數(shù)據(jù)單獨(dú)采用單因素方差分析方法檢驗(yàn)，得出各

A.空白組；B.模型組；C.600mg L-1 組；D.800mg L-1 組；E.1000mg L-1 組；F.甲氨蝶呤 2mg組圖 4 Wnt 通路和 RANKL 通路相關(guān)蛋白的 WB 表達(dá)條帶Figure 4. WB expression of Wnt pathway and RANKL pathway-associated prote表 3 DTYMT 對(duì) Wnt 通路和 RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達(dá)的影響(x±s，n=3)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2756016