【摘要】：目的:本研究在前期工作的基礎(chǔ)上,擬通過觀察斷藤益母湯對RAW264.7巨噬細胞誘導(dǎo)的破骨細胞分化、增殖及功能的影響,揭示斷藤益母湯抑制破骨細胞分化及其功能的分子機制,從而為臨床上應(yīng)用斷藤益母湯治療類風濕關(guān)節(jié)炎提供實驗依據(jù),并有助于進一步推廣斷藤益母湯的應(yīng)用,讓更多的病人獲益。方法:實驗一:建立RAW264.7巨噬細胞誘生破骨樣細胞模型,設(shè)立空白組,模型組,DTYMT400mg·L~(-1)、600mg·L~(-1)、800mg·L~(-1)、1000mg·L~(-1)濃度組和甲氨蝶呤2mg·L~(-1)組,制備斷藤益母湯凍干粉,并對各組進行相應(yīng)干預(yù)。實驗二:通過TRAP染色對破骨細胞進行鑒定,探討斷藤益母湯對破骨細胞分化的影響。實驗三:通過CCK-8法檢測各組細胞生存率,探討斷藤益母湯對破骨細胞增殖的影響。實驗四:通過蛋白免疫印跡法檢測Wnt和RANKL信號通路關(guān)鍵蛋白表達,探討斷藤益母湯對破骨細胞的分子通路作用機制。實驗五:通過ELISA檢測MMP-9炎癥因子水平,探討斷藤益母湯對炎癥因子的影響。結(jié)果:實驗一、二TRAP染色試驗顯示,與模型組相比,DTYMT400mg·L-1、600mg·L-1濃度組的融合細胞數(shù)量有所減少,但差異無統(tǒng)計學差異(P0.05);DTYMT800mg·L-1、1000mg·L-1濃度組融合細胞數(shù)目顯著減少,具有統(tǒng)計學意義(P0.01),提示當斷藤益母湯濃度達到一定水平后,可以有效抑制OC的分化。實驗三CCK8結(jié)果顯示,與模型組比較,DTYMT600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1濃度組和甲氨蝶呤2mg·L-1組生存率明顯下降(P0.05,P0.01),提示一定濃度的斷藤益母湯可以明顯抑制OC的增殖。實驗四免疫印跡結(jié)果顯示,與模型組相比,DTYMT1000mg·L-1組、甲氨蝶呤2mg·L-1組中RANKL蛋白表達量有所下降(P0.05)。DTYMT各組中的OPG蛋白表達水平無明顯上升或下降(P0.05);DTYMT800ug/ml、1000ug/ml濃度組、甲氨蝶呤2ug/ml組中Wnt3a、β-catenin蛋白表達量顯著上升,DKK1蛋白表達水平顯著下降,提示一定濃度的DTYMT可以有效降低RANKL表達水平,增加Wnt3a、β-catenin蛋白表達和下調(diào)DKK1表達。實驗五ELISA結(jié)果顯示,與模型組相比,DTYMD600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1濃度組及甲氨蝶呤組中的MMP-9表達水平均有所下降,且DTYMT濃度越高,下降越明顯,提示DTYMT能顯著降低MMP-9的表達水平。結(jié)論:1.當斷藤益母湯藥物濃度達到800ug/ml、1000ug/ml時,可以有效抑制OC的分化。2.當斷藤益母湯藥物濃度達到600ug/ml、800ug/ml、1000ug/ml時,對破骨細胞的增殖具有抑制效果,且藥物濃度越高,抑制效果越明顯。3.當斷藤益母湯藥物濃度達到800ug/ml、1000ug/ml時,可以增加Wnt3a、β-catenin蛋白表達和下調(diào)DKK1表達。當斷藤益母湯藥物濃度達到1000mg·L-1時,可以有效降低RANKL表達水平。斷藤益母湯各濃度組對OPG蛋白的表達無明顯影響。4.斷藤益母湯藥物濃度達到600mg·L-1、800mg·L-1、1000mg·L-1時,能顯著降低MMP-9的表達水平。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

24注：***P<0.01圖2 每視野下平均陽性細胞數(shù)。Figure 2. Average number of positive cells per field of view.4.3.2 斷藤益母湯對破骨細胞生存率的影響通過一般線性模型重復(fù)測量方差分析，得出組內(nèi)效應(yīng)檢驗結(jié)果 F=5.11,P=0.015>0.05，說明各組經(jīng)過不同的亞歐網(wǎng)濃度和干預(yù)時間之后，生存率存在差別，且具有統(tǒng)計學意義。同時藥物濃度與干預(yù)時間存在交互效應(yīng)。組間檢驗效應(yīng)結(jié)果顯示F=53.26，P=8.9063E-8<0.05，說明不同的藥物濃度組之間，生存率具有差異，且具有統(tǒng)計學意義。由圖 3 可知，模型組比較，DTYMT400mg L-1 組細胞生存率無明顯降低，；DTYMT600mg L-1、800mg L-1、1000mg L-1 濃度組和甲氨蝶呤 2mg L-1 組生存率均具有明顯下降，且與藥物濃度及干預(yù)時間相關(guān)，藥物濃度越高，干預(yù)時間越久，下降越明顯。

圖3.DTYMT對破骨細胞生存率影響Figure 3. Effect of DTMT on osteoclast survival4.3.3 斷藤益母湯對 Wnt 通路和 RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達的影響給藥干預(yù)細胞 24h 后，Wnt 通路和 RANKL 通路相關(guān)蛋白的表達條帶，如圖 17。對帶灰度行半定量分析，每個蛋白的數(shù)據(jù)單獨采用單因素方差分析方法檢驗，得出各

A.空白組；B.模型組；C.600mg L-1 組；D.800mg L-1 組；E.1000mg L-1 組；F.甲氨蝶呤 2mg組圖 4 Wnt 通路和 RANKL 通路相關(guān)蛋白的 WB 表達條帶Figure 4. WB expression of Wnt pathway and RANKL pathway-associated prote表 3 DTYMT 對 Wnt 通路和 RANKL 通路關(guān)鍵蛋白表達的影響(x±s，n=3)

【參考文獻】

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本文編號：2756016