【摘要】：骨質(zhì)疏松癥(Osteoporosis,OP)是嚴(yán)重威脅中老年健康的常見病和多發(fā)病之一,其特征在于骨量、強(qiáng)度和微結(jié)構(gòu)的系統(tǒng)性損害。骨代謝平衡是維持骨量的重要前提,而骨代謝的穩(wěn)定主要是由破骨細(xì)胞(osteoclasts,OCs)主導(dǎo)的骨吸收和成骨細(xì)胞(osteoblasts,OBs)主導(dǎo)的骨形成之間的動(dòng)態(tài)平衡所維持,當(dāng)骨吸收率超過骨形成率時(shí)骨質(zhì)疏松癥發(fā)生。當(dāng)歸芍藥散(Danggui Shaoyao San,DSS)是治療婦科疾病的常用復(fù)方之一,實(shí)驗(yàn)室前期研究證實(shí)DSS對去卵巢(OVX)誘導(dǎo)的OP大鼠具有顯著的骨保護(hù)作用,但其干預(yù)OP的作用是否與抑制OC的分化有關(guān)目前尚不明確。白芍作為DSS中的君藥,被廣泛用于中醫(yī)治療OP的常用處方中。芍藥苷(Paeoniflorin,PF)是白芍的主要活性成分,己被廣泛用于治療各種自身免疫疾病,如類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎和強(qiáng)直性脊柱炎等。但PF是否能夠抑制OCs分化及抗OP作用,目前尚缺乏更多的研究。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)DSS能夠顯著促進(jìn)新型膜雌激素受體G蛋白偶聯(lián)受體30(G protein-coupled receptor 30,GPR30)的蛋白表達(dá),同時(shí)PF能夠與存在于細(xì)胞膜上的雌激素受體(ER)結(jié)合。而GPR30被發(fā)現(xiàn)參與了OCs的分化。因此本實(shí)驗(yàn)主要研究了PF對OC分化的干預(yù)效應(yīng),以及PF干預(yù)OCs分化與膜雌激素受體GPR30的相關(guān)性,另外初探了PF對OB前體細(xì)胞凋亡的效應(yīng)。在文獻(xiàn)研究和前期實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)上,本課題主要圍繞以下幾點(diǎn)開展研究:1.DSS和PF對OCs分化的干預(yù)效應(yīng)建立脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的RAW 264.7細(xì)胞OCs分化模型,分組如下:Control組、LPS組、LPS+DSS組、LPS+PF組。培養(yǎng)4天后,抗酒石酸酸性磷酸酶(TRAP)染色和TRAP活性檢測顯示DSS(10-7 g/L,10-6 g/L)和PF(0.1 μM,1 μM,10 μM,25μM)均能顯著抑制TRAP 陽性細(xì)胞的產(chǎn)生和TRAP活性;另外,WB檢測顯示PF對OCs分化標(biāo)志蛋白TRAP、CTSK和NFATc1的表達(dá)具有顯著抑制作用,且呈劑量依賴性。建立了核因子受體激活劑(NF)-κB 配體(Receptor activator of nuclear factor-κ B ligand,RANKL)誘導(dǎo)的OCs分化模型,再次驗(yàn)證PF抑制OCs分化的作用。分組如下:Control組、RANKL組、RANKL+PF組。TRAP染色和TRAP活性檢測同樣顯示PF顯著減少了TRAP陽性細(xì)胞數(shù)目、抑制了TRAP活性。RT-PCR結(jié)果顯示PF對OCs分化標(biāo)志基因如CTSK、NFATc1、c-Fos和Dc-stamp的mRNA水平具有顯著抑制作用。2.PF對骨吸收效應(yīng)的干預(yù)作用為進(jìn)一步評價(jià)PF對骨吸收的影響,RAW 264.7細(xì)胞被接種到玻璃片或者骨磨片上,在LPS或RANKL存在條件下與不同濃度的PF共培養(yǎng)6 d。FITC標(biāo)記鬼筆環(huán)肽染色顯示PF可顯著抑制LPS和RNAKL誘導(dǎo)的肌動(dòng)蛋白環(huán)(Fibrous actin ring,F-actin ring)形成;甲苯胺藍(lán)染色顯示PF可顯著減少骨磨片上骨吸收窩陷數(shù)目。3.PF對OCs分化中活性氧水平及MAPKs和NF-κB信號通路的影響活性氧(reactive oxygen species,ROS)被認(rèn)為是OCs分化過程的第二信使,可激活OCs分化基本信號通路如MAPK(p38 MAPK,ERK和JNK)和NF-κB等信號傳導(dǎo)途徑,從而促進(jìn)OCs的分化。RAW 264.7細(xì)胞在LPS存在條件下與不同濃度PF共培養(yǎng)4 d,用流式細(xì)胞術(shù)觀察ROS水平,結(jié)果顯示PF能顯著抑制LPS誘導(dǎo)升高的ROS水平,尤其是10 μM PF。WB結(jié)果顯示,與刺激相同時(shí)間的LPS組比較,PF組可明顯降低P-p38/p38和P-p65/p65的蛋白比值。4.PF抑制OCs分化與GPR30的相關(guān)性文獻(xiàn)研究發(fā)現(xiàn)GPR30參與OCs分化過程。前述結(jié)果表明,PF對OCs分化具有顯著的抑制作用,為了進(jìn)一步探究PF抑制OCs分化與GPR30的相關(guān)機(jī)制,我們進(jìn)行以下實(shí)驗(yàn):(1)PF對LPS誘導(dǎo)OCs分化中GPR30蛋白表達(dá)的影響。WB結(jié)果顯示PF處理后以濃度依賴性方式促進(jìn)GPR30的表達(dá)。(2)加入GPR30特異性拮抗劑G15,觀察PF對LPS誘導(dǎo)ROS水平以及OCs分化的干預(yù)效應(yīng)。結(jié)果顯示,PF降低ROS水平的作用被G15拮抗了;PF抑制LPS誘導(dǎo)增加的TRAP 陽性細(xì)胞數(shù)目、增強(qiáng)的TRAP活性以及升高的OCs標(biāo)志基因mRNA水平的能力均被G15逆轉(zhuǎn)。(3)對RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行GPR30基因沉默,觀察PF對LPS誘導(dǎo)OCs分化的干預(yù)效應(yīng)。RT-PCR結(jié)果顯示GPR30沉默后PF抑制OCs標(biāo)志基因表達(dá)的作用消失。5.PF對潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚骨質(zhì)疏松癥的干預(yù)效應(yīng)(1)建立潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚OP模型。選取受精3天(3 dpf)的健康斑馬魚,分組:Control組、Model組(25 μM潑尼松龍)、PF組(1 μM 和10 μM)。除Control組,各組在給藥前預(yù)先給予潑尼松龍?jiān)炷? d,隨后連續(xù)給藥4 d。鈣黃綠素染色顯示PF對潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚幼魚第一椎骨的形成具有顯著促進(jìn)作用。RT-PCR結(jié)果顯示PF可促進(jìn)OBs標(biāo)志基因的表達(dá),同時(shí)抑制OCs標(biāo)志基因的表達(dá)。(2)建立潑尼松龍誘導(dǎo)的斑馬魚成魚尾鰭骨再生抑制模型。斑馬魚剪尾后,分組如下:Control組、Model組(25μM潑尼松龍)、Model+PF組(1μM 和10 μM),連續(xù)給藥14天。于第4、7、11和14天采集圖片,觀察斑馬魚尾鰭骨再生情況,結(jié)果顯示PF可顯著促進(jìn)斑馬魚成魚的尾鰭骨再生。尾鰭樣本RT-PCR檢測結(jié)果顯示PF可抑制OCs標(biāo)志基因、促進(jìn)OBs標(biāo)志基因的表達(dá)。6.PF對前成骨細(xì)胞凋亡的干預(yù)作用上述研究提示PF可促進(jìn)OBs介導(dǎo)的骨形成,而OBs是由前OBs分化而來,因此抑制前OBs凋亡有助于促進(jìn)骨形成。建立地塞米松(Dexamethasone,DEX)誘導(dǎo)的MC3T3-E1細(xì)胞凋亡模型,觀察PF抗前OBs凋亡作用。MTT顯示PF可緩解DEX對MC3T3-E1細(xì)胞活力的抑制作用,流式細(xì)胞術(shù)顯示PF可顯著降低細(xì)胞凋亡率。免疫熒光顯示PF可顯著抑制Fox03a的入核,WB顯示PF顯著促進(jìn)了Bcl-2的蛋白表達(dá)。結(jié)論:(1)DSS能夠抑制OCs分化。PF對OCs分化和骨吸收功能均具有顯著抑制作用,提示PF可能是DSS發(fā)揮抗OP作用的有效成分。(2)GPR30拮抗劑可逆轉(zhuǎn)PF對ROS水平的抑制作用,拮抗PF抑制LPS誘導(dǎo)的OCs分化的作用;GPR30沉默后,PF抑制OCs分化的作用被消除。以上提示PF可能通過GPR30/ROS依賴的途徑抑制OCs分化。(3)PF促進(jìn)OP斑馬魚幼魚第一椎骨生成和成魚尾鰭骨再生,同時(shí)抑制了OCs標(biāo)志基因的表達(dá),促進(jìn)了OBs標(biāo)志基因的表達(dá)。以上提示PF具有抗OP作用,并且是通過促進(jìn)骨形成和抑制骨吸收實(shí)現(xiàn)的。(4)PF可通過抑制Fox03a的核易位發(fā)揮抗前成骨細(xì)胞凋亡作用。綜上所述,PF可通過促進(jìn)GPR30蛋白表達(dá)抑制OCs分化,通過抑制Fox03a的核易位抗前OBs凋亡,從而抑制骨吸收促進(jìn)骨形成,維持骨穩(wěn)態(tài),發(fā)揮OP治療作用。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285
【圖文】：

研究假說:芍藥普干預(yù)破骨細(xì)胞分化可能與GPR30密切相關(guān)

．邐ｔ邐．邐，邐．逡逑，，－．邋■邋＊逡逑圖１－１－２邋ＬＰＳ對ＴＲＡＰ陽性細(xì)胞生成的影響。（Ｘ２００，標(biāo)尺＝１００邋ｐｍ）逡逑Ｆｉｇ．邋１－１－２邋Ｔｈｅ邋ｅｆｆｅｃｔ邋ｏｆ邋ＬＰＳ邋ｏｎ邋ｔｈｅ邋ｐｒｏｄｕｃｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＴＲＡＰ邋ｐｏｓｉｔｉｖｅ邋ｃｅｌｌｓ．邋（ｘ２００，邋Ｓｃａｌｅ邋ｂａｒｓ：邋１００逡逑嘩）逡逑

１－１邋ＲＡＷ邋２６４．７細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察。（ｘ４００，標(biāo)尺：１０ｈｏｌｏｇｉｃａｌ邋ｏｂｓｅｒｖａｔｉｏｎ邋ｏｆ邋ＲＡＷ邋２６４．７邋ｃｅｌｌｓ．邋（ｘ４００，邋Ｓｃａｌ激ＲＡＷ２６４．７細(xì)胞４天，ＴＲＡＰ染色結(jié)果表明，Ｔ比，ＬＰＳ各組ＴＲＡＰ陽性細(xì)胞數(shù)目均顯著增多，但性細(xì)胞數(shù)目無顯著差異，且與１００邋ｎｇ／ｍＬ以下ＬＰ勢（圖１－１－２）。原因可能是大于１００邋ｎｇ／ｍＬＬＰＳ對前體數(shù)目減少，最終導(dǎo)致ＯＣ數(shù)目降低。逡逑１０邋ｎｇ／ｍＬ邋ＬＰＳ邐５０＇邐，，邐？，邐＾邐＾邋－ｔ邋％邐ｉ逡逑．、邐■．逡逑＊邋、邋．邋．

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