【摘要】：目的:探討草烏甲素對(duì)過(guò)敏性哮喘小鼠模型肺部炎癥的治療效果及其可能的機(jī)理;分析草烏甲素對(duì)LPS激發(fā)的RAW264.7細(xì)胞炎癥模型的抗炎效果及其潛在的分子機(jī)制。方法:60只SPF級(jí)Balb/c雌鼠(20±2g),隨機(jī)分為6組:陰性對(duì)照組(NC組);哮喘組(Asthma組);草烏甲素低劑量治療組(BLA-L組:0.16 mg/kg);草烏甲素中劑量治療組(BLA-M組:0.32 mg/kg);草烏甲素高劑量治療組(BLA-H組:0.48 mg/kg);地塞米松陽(yáng)性治療組(Dex組:1 mg/kg)。哮喘組及BLA各劑量組分別于第0、7及14天進(jìn)行OVA 10μg與2%氫氧化鋁混懸液0.2m L腹腔注射。從第22天起,各組小鼠霧化吸入5%OVA致敏液激發(fā),每天一次,每次30分鐘,持續(xù)霧化7天。陰性對(duì)照組用PBS代替致敏液,其余條件與用藥組相同。每次霧化前30分鐘,BLA低劑量組、中劑量組以及高劑量組小鼠分別給予BLA0.16mg/kg、0.32mg/kg、0.48mg/kg,腹腔注射0.2m L,陰性對(duì)照組及哮喘組則用等量的PBS代替。第28天處死小鼠。(1)收集血清,酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)檢測(cè)血清中總Ig E、總Ig G水平;(2)收集支氣管肺泡灌洗液(BALF),ELISA法檢測(cè)細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TNF-α與MCP-1水平;同時(shí)對(duì)BALF中的白細(xì)胞(包括白細(xì)胞總數(shù)、嗜酸性粒細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、巨噬細(xì)胞)進(jìn)行細(xì)胞分類計(jì)數(shù);(3)取肺組織并進(jìn)行常規(guī)石蠟包埋,行HE染色觀察組織學(xué)改變;(4)Western Blotting檢測(cè)肺組織中NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白NF-κB1與PKC-δ的表達(dá)水平。小心從液氮罐中取出凍存的RAW264.7,細(xì)胞復(fù)蘇后添加10%的胎牛血清、1%青霉素與鏈霉素的雙抗的DMEM高糖完全培養(yǎng)基在37℃、5%的CO2培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng),細(xì)胞經(jīng)傳代后凍存留種用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。細(xì)胞種板后設(shè)置如下組別:Control組,單用草烏甲素組(60μg/m L),LPS組(100μg/m L),LPS+BLA(10μg/m L),LPS+BLA(30μg/m L),LPS+BLA(60μg/m L),收集細(xì)胞后進(jìn)行如下檢測(cè)。(5)培養(yǎng)巨噬細(xì)胞RAW264.7,CCK-8確定藥物安全范圍;(6)ELISA法檢測(cè)細(xì)胞上清液炎癥因子IL-1β、IL-6、TNF-α和MCP-1的水平;(7)WB檢測(cè)NF-κB信號(hào)通路中關(guān)鍵蛋白同(4)。結(jié)果:小鼠血清中總Ig E、總Ig G的水平的結(jié)果表明,與哮喘組(64.16±5.91)ng/m L相比,草烏甲素低中高治療組(44.38±3.56)、(32.48±2.62)、(24.54±2.11)ng/m L、Dex組(25.48±1.30)ng/m L總Ig E水平明顯降低(P0.01),其中用藥組中高劑量組效果最為顯著;與哮喘組(34.38±2.08)ng/m L相比,BLA-L組(25.41±1.19)ng/m L、BLA-M組(18.66±0.78)ng/m L、BLA-H組(17.70±0.63)ng/m L的總Ig G含量顯著降低(P0.01);而Dex組(15.72±0.46)ng/m L的Ig G含量最低。由此我們認(rèn)為,草烏甲素治療可顯著降低血清總Ig E和總Ig G水平,并呈現(xiàn)劑量依賴性。肺泡灌洗液中細(xì)胞因子IL-4、IL-10、TNF-α與MCP-1的水平結(jié)果表明:與哮喘組(339.47±2.52)pg/m L相比,草烏甲素低中、高處理組BALF(298.82±3.86)、(277.89±7.53)、(277.81±5.98)pg/m L中IL-4的含量降低(P0.01)。與哮喘組(454.25±23.16)pg/m L相比,草烏甲素低中、高處理組(376.24±27.12)、(260.10±17.59)、(245.50±17.92)pg/m L中TNF-α含量逐步降低(P0.01)且BLA-H組效果最佳。草烏甲素中、低、高處理組的細(xì)胞因子IL-10均大于哮喘組(26.20±1.35)pg/m L(P0.01),Dex組(99.00±4.35)與BLA-H組(97.53±8.60)pg/m L無(wú)差異。NC組、AS組、BLA-L組、BLA-M組、BLA-H組、Dex組的細(xì)胞因子MCP-1水平分別為(336.15±37.81)、(670.64±52.74)、(630.68±37.66)、(410.39±10.97)、(518.13±25.20)、(360.97±21.66)pg/m L。與哮喘組相比,BLA-L組MCP-1含量下降(P0.05),而BLA-M組與BLA-H組含量顯著減少(P0.01)。不同劑量草烏甲素能有效抑制哮喘小鼠肺泡灌洗液中炎性因子IL-4、TNF-α與MCP-1的含量。為了了解草烏甲素對(duì)肺泡灌洗液中細(xì)胞數(shù)量的影響,我們對(duì)其進(jìn)行分類計(jì)數(shù)。結(jié)果草烏甲素處理組的Eos數(shù)量明顯低于哮喘組(5.58±0.22)×104/m L(P0.01);與BLA-H組(1.46±0.16)×104/m L相比,Dex組治療(1.29±0.20)×104/m L的效果更佳。與哮喘組(0.47±0.05)相比,BLA-M組(0.35±0.04)、BLA-H組(0.30±0.03)、Dex組(0.39±0.04)×104/m L淋巴細(xì)胞數(shù)量降低(P0.05),BLA-L組(0.52±0.07)×104/m L對(duì)淋巴細(xì)胞的抑制作用不顯著(P0.05)。草烏甲素處理組巨噬細(xì)胞數(shù)顯著低于哮喘組(4.85±0.34)(P0.01)。與BLA-L組(2.36±0.36)相比,BLA-M組(1.75±0.20)、BLA-H組(1.13±0.19)及Dex組(1.25±0.26)×104/m L巨噬細(xì)胞減少(P0.01)。BLA-H組與Dex組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。肺組織HE染色顯示草烏甲素治療后能顯著減輕肺部炎性細(xì)胞浸潤(rùn),且結(jié)構(gòu)完整性明顯改善,其中BLA-H組效果最明顯。WB檢測(cè)結(jié)果表明BLA處理可引起肺組織中NF-κB信號(hào)通路NF-κB1與PKC-δ表達(dá)下調(diào)。CCK-8實(shí)驗(yàn)表明草烏甲素在小于60μg/m L濃度時(shí)對(duì)RAW264.7細(xì)胞活力沒(méi)有顯著影響,因此將10、30和60μg/m L濃度分別作為后續(xù)實(shí)驗(yàn)的低、中、高劑量組。草烏甲素能有效抑制LPS誘導(dǎo)RAW264.7細(xì)胞炎癥因子及炎癥介質(zhì)IL-6、TNF-α和MCP-1的含量,IL-1β的表達(dá)沒(méi)有意義。草烏甲素能有效抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞轉(zhuǎn)錄因子NF-κB信號(hào)通路中NF-κB1和PKC-δ入核。結(jié)論:1.草烏甲素能夠減輕過(guò)敏性哮喘小鼠的肺部炎癥狀態(tài);可能是通過(guò)抑制PKC-δ/NF-κB信號(hào)實(shí)現(xiàn)的。2.草烏甲素抑制LPS誘導(dǎo)的RAW264.7細(xì)胞炎性因子IL-6,TNF-α和MCP-1的釋放。3.草烏甲素通過(guò)抑制LPS誘導(dǎo)的NF-κB信號(hào)通路的活化從而發(fā)揮抗炎作用。
【學(xué)位授予單位】：皖南醫(yī)學(xué)院
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

圖 1.草烏甲素分子結(jié)構(gòu)圖擬通過(guò)以下研究探討 BLA 在過(guò)敏性哮喘小鼠中的抗炎作用：過(guò)卵白蛋白（Ovalbumin，OVA）致敏 Balb/c 雌鼠，建立

動(dòng)物模型復(fù)制示意圖

圖 3.草烏甲素對(duì)血清總 IgE、總 IgG 的影響 組相比，P < 0.01；b，與 BLA-L 組相比，P < 0.01；c，與 BLA-M 相相比，P < 0.01；b，與 BLA-L 組相比，P < 0.01；c，與 BLA-M 組相LA-H 組相比，P < 0.05。

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本文編號(hào)：2752656