【摘要】：目的:動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)是常見的心血管系統(tǒng)疾病,隨著人們生活水平的提高,AS的發(fā)病率有逐年上升趨勢,嚴重危害人類健康。AS的病因復(fù)雜,機制尚不完全明確,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)認為,AS病變基礎(chǔ)為脂質(zhì)代謝障礙,血管內(nèi)膜受損,脂質(zhì)和復(fù)合糖類積聚、出血及血栓形成,進而纖維組織增生及鈣質(zhì)沉著,形成動脈粥樣硬化斑塊,并有動脈中層的逐漸蛻變和鈣化,導(dǎo)致動脈壁增厚變硬、血管腔狹窄,最終導(dǎo)致各種心血管事件的發(fā)生。臨床上治療AS藥物較多,但作用效果不理想。車前子屬于利水滲濕藥,有清熱利尿、滲濕通淋、清肝明目、止咳驅(qū)痰等功效,現(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究發(fā)現(xiàn),車前子有抗動脈粥樣硬化、抗炎、降血脂等作用~([176]),但抗AS的有效成分及作用機制不清楚。本文利用計算機分子對接技術(shù)篩選了車前子中調(diào)控巨噬細胞膽固醇代謝的有效化合物,并選取車前子中一種化合物京尼平苷酸(Geniposidic acid,GPA)作為研究對象;全面考察了京尼平苷酸對人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1膽固醇代謝調(diào)控相關(guān)蛋白的影響;進一步探討了京尼平苷酸抗動脈粥樣硬化可能機制,為其進一步開發(fā)提供基礎(chǔ)理論數(shù)據(jù)。方法:1.車前子的成分與巨噬細胞膽固醇調(diào)控相關(guān)蛋白虛擬分子對接研究利用計算機虛擬篩選方法建模,以中藥車前子的55個化學(xué)成分為對象,選取3個與巨噬細胞膽固醇代謝調(diào)控密切相關(guān)的靶蛋白ATP結(jié)合盒轉(zhuǎn)運體A1(ATP-binding cassette transporter A1,ABCA1)、清道夫受體CD36(Scavenger receptor CD36,CD36),血凝素樣氧化型低密度脂蛋白受體-1(Lectin-like oxidized low-density lipoprotein receptor-1,LOX-1)作為受體,采用SYBYL分子對接方法,以Total Score結(jié)合打分為標準,篩選得分最高的化合物,同時觀察其MOLCAD顯示的與相關(guān)蛋白表面疏水性和氫鍵供體與受體區(qū)域,利用Discovery Studio 2016軟件進行分析,預(yù)測其結(jié)合模式及親和力。2.京尼平苷酸對氧化性低密度脂蛋白(Oxidized low-density lipoprotein,oxLDL)誘導(dǎo)的人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1膽固醇代謝調(diào)控機制研究用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人單核細胞THP-1,160nM丙二醇甲醚醋酸酯(Phorbol-12-myristate-13-acetate,PMA)誘導(dǎo)人單核細胞THP-1分化為巨噬細胞。從車前子成分中選擇1個Total Score打分較高化合物(京尼平苷酸)作為研究對象。第一批分組:設(shè)oxLDL(50mg/L)組、oxLDL+GPA(200mg/L)組、oxLDL+GPA(100mg/L)、oxLDL+GPA(50mg/L)組。第二批分組:設(shè)空白對照(CONTROL)組,oxLDL(50mg/L)組,GPA(200mg/L)+oxLDL組,GPA(200mg/L)+oxLDL+Compund C(10μM)組。培養(yǎng)24h后,油紅O染色觀察泡沫細胞內(nèi)脂滴變化;采用RT-PCR方法檢測ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1、SR-A1、SR-B1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;使用蛋白免疫印跡(Western Blot,WB)法檢測ABCG1、ABCA1、CD36蛋白表達水平。3.京尼平苷酸對脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)誘導(dǎo)的人單核巨噬細胞THP-1炎性因子分泌的影響用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人單核細胞THP-1,160nM誘導(dǎo)人單核細胞THP-1分化為巨噬細胞。設(shè)空白對照(CONTROL)組,LPS(500ng/mL)組,GPA(200mg/L)+LPS組,GPA(200mg/L)+LPS+BAY11-7082(10mM)組。培養(yǎng)24h后,油紅O染色觀察巨噬細胞內(nèi)脂滴變化;提取核酸RT-PCR方法檢測ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1、SR-A1、SR-B1、TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、CD206、IL-10mRNA的轉(zhuǎn)錄水平;提取蛋白WB法檢測ABCG1、ABCA1、CD36蛋白表達水平;收集培養(yǎng)上清液,通過ELISA方法檢測各組上清液中TNF-α、IL6濃度。設(shè)空白對照(CONTROL)組,LPS(500ng/mL)組,GPA(200mg/L)+LPS組。使用DCFH-DA探針37℃下作用30min,流式細胞術(shù)檢測GPA對人單核巨噬細胞THP-1活性氧的影響,倒置熒光顯微鏡觀察細胞內(nèi)活性氧水平變化。4.京尼平苷酸對PPARγ信號通路介導(dǎo)膽固醇調(diào)控機制的研究用含10%胎牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)人單核細胞THP-1,160nM PMA誘導(dǎo)人單核細胞THP-1分化為巨噬細胞。設(shè)空白對照(CONTROL)組,oxLDL(50mg/L)組、oxLDL+GPA(200mg/L)組、oxLDL+GPA(200mg/L)+GW9662(PPARγ抑制劑)、oxLDL+GPA(200mg/L)+BRL(PPARγ激活劑),處理24小時后,提取核酸RT-PCR方法檢測PPARγ、LXR-α、ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1 mRNA的轉(zhuǎn)錄水平。結(jié)果:1.通過計算機虛擬分子對接技術(shù),篩選并選取了與ABCA1蛋白結(jié)合打分較高的京尼平苷酸作為研究對象。通過SYBYL分子對接的方法,觀察到車前子中有3個化合物與調(diào)節(jié)泡沫細胞膽固醇代謝中ABCA1蛋白結(jié)合Total Score打分較高,同時3個化合物與ABCA1蛋白結(jié)合,可產(chǎn)生多種分子間作用力,使小分子牢固地結(jié)合在活性位點。從車前子成分中選擇1個Total Score打分較高化合物(京尼平苷酸)作為研究對象,根據(jù)供貨方提供的數(shù)據(jù),本實驗使用的GPA為純度99.3221%單一化合物。CCK8細胞增殖抑制率實驗結(jié)果顯示,京尼平苷酸各劑量組(200mg/L、100mg/L、50mg/L)對人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1增殖抑制率未見明顯影響。2.oxLDL誘導(dǎo)人單核巨噬細胞THP-1建立泡沫細胞模型,GPA可通過提升ABCA1、ABCG1基因和蛋白表達水平,降低LOX-1、CD36基因或蛋白表達水平,來降低泡沫細胞內(nèi)膽固醇的含量;以上作用效果可被AMPK抑制劑(Compund C)抑制。GPA可劑量依賴性影響ABCA1、ABCG1、LOX-1、CD36基因或蛋白表達水平。oxLDL(50mg/L)作用人單核巨噬細胞THP-1經(jīng)GPA、GPA+Compund C處理24小時后,oxLDL(50mg/L)組油紅O染色見胞內(nèi)充滿大量紅色脂滴,呈泡沫樣改變,經(jīng)異丙醇萃取胞內(nèi)膽固醇后,與空白組有明顯差異,即成功建立了泡沫細胞模型;RT-PCR結(jié)果說明,人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1中ABCA1、ABCG1 mRNA表達降低,LOX-1、CD36表達升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01);WB結(jié)果顯示,oxLDL組的ABCA1、ABCG1蛋白表達水平顯著降低,而CD36的蛋白表達水平顯著升高。油紅O染色結(jié)果顯示,京尼平苷酸(200mg/L、100mg/L)能顯著降低人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1內(nèi)脂滴的含量;RT-PCR結(jié)果說明,京尼平苷酸(200mg/L、100mg/L)能提高ABCA1、ABCG1 mRNA表達水平,降低LOX-1、CD36 mRNA表達水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01),對SR-A1,SR-B1 mRNA表達水平未見顯著影響(P0.05);WB結(jié)果顯示,京尼平苷酸(200mg/L)組能提高ABCA1、ABCG1蛋白的表達水平,能降低CD36蛋白表達水平。AMPK抑制劑(Compund C)能抑制GPA(200mg/L)對ABCA1、ABCG1mRNA表達水平提高及對CD36、LOX-1mRNA表達水平降低的作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);AMPK抑制劑(Compund C)能顯著降低ABCG1蛋白的表達水平,能顯著提高CD36蛋白的表達水平。京尼平苷酸200、100、50mg/L劑量組作用泡沫細胞24小時后,與oxLDL組相比,京尼平苷酸200、100mg/L劑量組能提高ABCA1、ABCG1 mRNA的表達水平(P0.05),降低CD36、LOX-1的表達水平(P0.05),對SR-B1、SR-A1表達水平未見顯著性變化(P0.05);與oxLDL組相比,京尼平苷酸200、100mg/L能提高ABCA1、ABCG1的蛋白表達水平,降低CD36的表達水平。3.LPS刺激了人單核巨噬細胞THP-1產(chǎn)生炎性反應(yīng),GPA能通過改善胞內(nèi)氧化應(yīng)激,降低NF-κB基因表達水平,來降低炎性因子IL-6、TNF-α的基因表達水平和細胞上清液中TNF-α、IL-6的濃度。TLR4、NF-κB、IL-6、TNF-α、CD206、IL-10 RT-PCR檢測結(jié)果:LPS誘導(dǎo)的人單核巨噬細胞THP-1經(jīng)GPA、GPA+BAY11-7082處理24小時后,提取核酸RT-PCR方法檢測mRNA表達水平。與CONTROL組相比,LPS組的TLR4、IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達水平顯著升高(P0.05),而CD206、IL-10的表達水平顯著降低(P0.01);與LPS組相比,GPA(200mg/L)組能顯著降低IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達水平,顯著提高CD206、IL-10的表達水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01),對TLR4未見明顯影響(P0.05)。與京尼平苷酸(200mg/L)組相比,NF-κB抑制劑(BAY11-7082)組能進一步降低IL-6、TNF-α、NF-κB mRNA的表達水平,進一步提高CD206的表達水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);對IL-10的表達水平有進一步提高的趨勢(P0.05),對TLR4未見明顯影響(P0.05)。LPS刺激人單核巨噬細胞THP-1分泌TNF-α、IL-6,通過ELISA方法檢測各組細胞上清液中TNF-α、IL-6的濃度。ELISA結(jié)果顯示,GPA能抑制人單核巨噬細胞THP-1分泌TNF-α、IL-6,NF-κB抑制劑(BAY11-7082)組能進一步降低細胞上清液中IL-6、TNF-α的濃度。人單核巨噬細胞THP-1經(jīng)LPS處理后,細胞內(nèi)ROS水平較對照組明顯增強,加入GPA(200mg/L)24小時后,LPS誘導(dǎo)增加的細胞內(nèi)ROS水平被抑制。油紅O染色經(jīng)異丙醇萃取胞內(nèi)膽固醇后,LPS組比空白組有增加膽固醇趨勢;與LPS組比,京尼平苷酸(200mg/L)組有降低胞內(nèi)膽固醇含量的趨勢。ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1、SR-A1、SR-B1 RT-PCR檢測結(jié)果:與CONTROL組相比,LPS組的ABCA1、ABCG1 mRNA的表達水平有降低趨勢,而CD36、LOX-1的表達水平有升高趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),SR-B1、SR-A1表達水平未見顯著性變化(P0.05);與oxLDL組相比,京尼平苷酸(200mg/L)組有提高ABCA1、ABCG1 mRNA的表達水平的趨勢,具有降低CD36、LOX-1 mRNA的表達水平的趨勢,差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05),對SR-B1、SR-A1表達水平未見顯著性變化(P0.05)。與京尼平苷酸(200mg/L)組相比,NF-κB抑制劑(BAY11-7082)組對ABCA1、ABCG1、CD36、SR-B1、SR-A1未見影響(P0.05)。4.oxLDL誘導(dǎo)人單核巨噬細胞THP-1建立泡沫細胞模型,GPA能提高PPARγ、LXR-α的基因表達水平,從而提高了ABCA1、ABCG1的基因表達水平,降低了CD36、LOX-1的基因表達水平。oxLDL誘導(dǎo)的人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1經(jīng)GPA、GPA+GW9662、GPA+BRL處理24小時后,提取核酸RT-PCR方法檢測mRNA表達水平。PPARγ、LXR-αRT-PCR檢測結(jié)果:與CONTROL組相比,oxLDL組的PPARγ、LXR-αmRNA的表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與oxLDL組相比,京尼平苷酸(200mg/L)組能顯著提高PPARγ、LXR-αmRNA的表達水平,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);與京尼平苷酸(200mg/L)組相比,GW9662(PPARγ抑制劑)組能抑制京尼平苷酸提高PPARγ、LXR-αmRNA的表達水平的作用,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.01);BRL(PPARγ激活劑)組對PPARγ、LXR-αmRNA的表達水平未見顯著變化,無統(tǒng)計學(xué)差異(P0.05)。ABCA1、ABCG1、CD36、LOX-1檢測結(jié)果:與oxLDL組相比,GPA(200mg/L)組的ABCA1、ABCG1 mRNA顯著升高,CD36、LOX-1 mRNA表達水平顯著降低,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01);與GPA(200mg/L)組相比,GPA+GW9662組的ABCA1、ABCG1 mRNA的表達水平顯著降低,CD36、LOX-1mRNA表達水平顯著升高,差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05或P0.01);與GPA(200mg/L)組相比,GPA(200mg/L)+BRL組的ABCA1、ABCG1 mRNA的表達水平顯著升高(P0.05),CD36、LOX-1 mRNA表達水平未見顯著變化(P0.05)。結(jié)論:利用計算機虛擬分子對接技術(shù)對車前子成分進行化合物篩選,把其中與受體ABCA1對接打分較高的化合物京尼平苷酸作為研究對象。通過體外細胞實驗研究發(fā)現(xiàn),京尼平苷酸能夠影響人單核巨噬細胞源泡沫細胞THP-1膽固醇代謝,與APMK、PPARγ介導(dǎo)的膽固醇調(diào)控信號通路有關(guān);同時,京尼平苷酸能夠抑制人單核巨噬細胞THP-1炎性因子分泌,是通過對NF-κB介導(dǎo)的炎性因子信號通路起作用。
【學(xué)位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

胞在 AS 發(fā)生發(fā)展的各個階段起重要作用[19]。炎癥內(nèi)皮細胞釋核細胞依附在異常損傷的動脈內(nèi)膜并侵入內(nèi)膜。由于血流變化脂質(zhì)積累，血管部位損傷或動脈粥樣化異常，從而引起單核胞趨化。在內(nèi)皮下層，單核細胞分化為巨噬細胞，在內(nèi)環(huán)境中的刺激下，巨噬細胞可分化為促炎癥/抗炎癥兩種表型，最終0]。泡沫細胞的形成發(fā)生在動脈粥樣硬化初始階段，是動脈粥22]。氧化型低密度脂蛋白的攝入增加或膽固醇外流減少導(dǎo)致巨醇脂質(zhì)的聚集和泡沫細胞的形成[23]。在巨噬細胞中，oxLDL夫受體完成的（圖 1）[24]。主要包括：CD36、SR-A1、LOX膽固醇�；D(zhuǎn)移酶-1（ACAT1）和中性膽固醇酯水解酶（nce形成[25]。ABCA1 和 ABCG1 和 SR-B1 促進了巨噬細胞膽固醇了解動脈粥樣硬化發(fā)展中調(diào)節(jié)膽固醇代謝分子機制研究，有助脈粥樣硬化的關(guān)系，以下闡述了巨噬細胞中負責膽固醇調(diào)控的膽固醇逆轉(zhuǎn)運的關(guān)鍵機制，特別是在巨噬細胞中的機制。

廣州中醫(yī)藥大學(xué) 2018 屆博士學(xué)位論文MOLO00086-001 N/A 387-80-4 11.4517MOLO07815-001 車前草苷 D 147331-98-4 10.4517MOLO06682-001 木通苯乙醇苷 A 84744-28-5 10.287MOLOO0158-000 木通苯乙醇苷 B 105471-98-5 9.2624利用 SYBYL 分子對接，得出車前子的 55 個小分子配體與 3 個靶標蛋分子對接結(jié)合打分整體情況（見表 2），得分最高的為以下小分子：西托異類葉升麻苷、京尼平苷酸和車前草苷 D，均有文獻報道其為車前子主要成打分具體情況及各小分子的結(jié)構(gòu)（見表 2，圖 2）。對打分得分最高的化合行 MOLCAD 展示了靶蛋白的表面疏水性和氫鍵供體與受體區(qū)域，以及靶蛋白合物的結(jié)合作用模式圖（圖 3-5）。

究其三維結(jié)構(gòu)與 ABCA1 靶蛋白的相互作用，并以 MOLCAD 展示了與靶蛋白的表面疏水性和氫鍵供體與受體區(qū)域。觀察到 ABCA1 的活性口袋中，存在多處氫鍵受體和氫鍵供體，借助 Discovery Studio 2016 軟件對其進行相互作用的分析，發(fā)現(xiàn)異類葉升麻苷與靶蛋白的 SER264、LEU316、GLU267、ARG305、MET298位點可有效的結(jié)合產(chǎn)生氫鍵，與 PHE335、LEU331、PHE326、THR258、PHE257、ILE295、TRP443、VAL263、LEU260、PHE315、GLU301 位點有范德華引力的相互作用。（三）京尼平苷酸與 ABCA1(5XJY）分子對接結(jié)果（見圖 5）京尼平苷酸與 ABCA1 蛋白分子對接 Total Score 結(jié)合打分為 11.6992。研究其三維結(jié)構(gòu)與 ABCA1 靶蛋白的相互作用，并以 MOLCAD 展示了與靶蛋白的表面疏水性和氫鍵供體與受體區(qū)域。觀察到 ABCA1 的活性口袋中，存在多處氫鍵受體和氫鍵供體，借助 Discovery Studio 2016 軟件對其進行相互作用的分析，發(fā)現(xiàn)京尼平苷酸與靶蛋白的 LEU260、MET298、GLU301、SER264、ARG305、GLU267 位點可有效的結(jié)合產(chǎn)生氫鍵，與 VAL263、LEU316、LEU299、ILE295、PHE335、ILE339、LEU331、THR302、ALA261 位點有范德華引力的相互作用。

【參考文獻】

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本文編號：2752621