【摘要】：梅花鹿茸是我國傳統(tǒng)的名貴中藥,而鹿血中又含有多種生物活性物質(zhì),二者早在幾千年前就已作為藥用或者保健滋補(bǔ)佳品。污染物的存在會直接影響梅花鹿茸及鹿血相關(guān)產(chǎn)品質(zhì)量,給使用安全帶來巨大隱患,因此研究優(yōu)化梅花鹿茸及鹿血中污染物殘留的檢測方法十分重要。本文以梅花鹿主要人畜共患病病原微生物布魯氏菌和結(jié)核分枝桿菌為檢測對象,建立了梅花鹿茸及鹿血的布魯氏菌和結(jié)核分枝桿菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。同時,針對于化學(xué)保定取茸技術(shù)導(dǎo)致麻醉藥殘留的現(xiàn)狀,建立了兩種獸用麻醉藥賽拉嗪和二甲苯胺噻嗪的超高液相-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用和三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用檢測方法。本論文研究內(nèi)容主要分為四部分:(1)根據(jù)已報(bào)道的布魯氏菌特異性基因序列IS711,設(shè)計(jì)并送生物公司合成引物和熒光探針,以成功制備的標(biāo)準(zhǔn)品為模板,建立布魯氏菌實(shí)時熒光定量PCR檢測體系,并對該方法的重復(fù)性、特異性和敏感性進(jìn)行評價。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以布魯氏菌IS711標(biāo)準(zhǔn)陽性質(zhì)粒為模板重復(fù)做四組,于相同的條件下完成反應(yīng),Ct值分別為15.13、16.58、16.17、17.09,說明該方法重復(fù)性良好。以豬布魯氏菌S2(B.suis S2)、牛布魯氏菌S19(B.abortus S19)、羊布魯氏菌M5(B.melitensis M5)、結(jié)核分枝桿菌H37Rv(Mycobacterium tuberculosis H37Rv)、牛病毒性腹瀉病毒NADL(Bovine viral diarrhea virus NADL,BVDV NADL)為模板,對該體系的特異性進(jìn)行考察。結(jié)果顯示,結(jié)核分枝桿菌H37Rv、BVDV NADL為模板均沒有明顯的擴(kuò)增曲線,可判定為陰性,說明該體系特異性良好。所繪制的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)R~2值為0.996,呈良好的線性相關(guān)關(guān)系。將已知濃度的陽性標(biāo)品梯度稀釋,最小檢測拷貝數(shù)為4 Copies/uL,說明該方法具有良好的敏感性。應(yīng)用所建立的方法,對目的性采集的鹿場中有布魯氏菌病患病相似癥狀,疑似陽性鹿血及鮮鹿茸樣品進(jìn)行方法的對比驗(yàn)證,其中30份PPD鹿血陽性樣品中,15份呈陽性,2份疑似陽性;30份PPD鮮鹿茸陽性樣品中,15份呈陽性,成功構(gòu)建了簡單快速、靈敏性高、特異性強(qiáng)的檢測方法。(2)根據(jù)結(jié)核分枝桿菌基因序列Rv3873,設(shè)計(jì)合成特異性引物和探針,并通過單因素考察試驗(yàn),優(yōu)化該體系反應(yīng)條件,以成功制備的標(biāo)準(zhǔn)品為模板,建立了結(jié)核分枝桿菌實(shí)時熒光定量PCR檢測方法。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明,以構(gòu)建好的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒為模板重復(fù)做四組,Ct值分別為19.22、19.23、19.11、18.26,說明該方法重復(fù)性良好。結(jié)核分枝桿菌H37Rv、牛結(jié)核分枝桿菌(M.bovis)、豬布魯氏桿菌S2、牛布魯氏菌S19、牛病毒性腹瀉病毒NADL為模板,進(jìn)行特異性檢測。結(jié)果顯示,豬布魯氏桿菌S2、牛布魯氏菌S19、牛病毒性腹瀉病毒NADL為模板均沒有明顯的擴(kuò)增曲線,說明該體系特異性良好。所獲得的動力學(xué)曲線相關(guān)系數(shù)R~2值為0.999,呈良好的線性相關(guān)關(guān)系。將標(biāo)準(zhǔn)樣品的原始濃度進(jìn)行10倍倍比稀釋,最小檢測拷貝數(shù)為4 Copies/uL,說明該方法具有良好的敏感性。應(yīng)用建立的實(shí)時熒光定量PCR方法對模擬感染樣品進(jìn)行驗(yàn)證,結(jié)果顯示,陽性組織樣品100%被檢出,陽性鹿血樣品檢出率83.33%,所建立方法的檢測準(zhǔn)確率高于普通PCR檢測方法。(3)建立了超高液相-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)檢測梅花鹿茸、鹿血中獸用麻醉藥賽拉嗪殘留的方法,分別對樣品的前處理技術(shù)、提取條件、色譜條件等進(jìn)行優(yōu)化,并對該方法的精密度和準(zhǔn)確度進(jìn)行評價。結(jié)果顯示,賽拉嗪在鹿茸和鹿血中的檢出限為0.1 ng/mL~0.5 ng/mL,定量下限為0.2 ng/mL~1.0 ng/mL且R~2值為0.9968,成功構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,所建立的方法重現(xiàn)性好、快速準(zhǔn)確,適用于梅花鹿茸及鹿血相關(guān)產(chǎn)品中的獸用麻醉藥殘留檢測。(4)建立了三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用技術(shù)檢測梅花鹿茸、鹿血中獸用麻醉藥二甲苯胺噻嗪殘留的方法,通過優(yōu)化樣品處理?xiàng)l件及對色譜柱的選擇,能夠?qū)Σ杉臉悠愤M(jìn)行準(zhǔn)確定量,并考察該方法的適用性。結(jié)果顯示,二甲苯胺噻嗪在鹿茸和鹿血中的檢出限為20ng/mL,定量下限為50 ng/mL。計(jì)算得到線性方程為Y=8966X-451812,R~2值為0.9919,成功構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明,所建立的方法準(zhǔn)確高效,為中藥梅花鹿茸質(zhì)量安全評價提供技術(shù)支持。本研究建立了梅花鹿茸、鹿血中兩種主要病原微生物布魯氏菌和結(jié)核分枝桿菌的實(shí)時熒光定量PCR檢測方法及兩種獸用麻醉藥的超高液相-三重四級桿質(zhì)譜聯(lián)用和三重四級桿氣質(zhì)聯(lián)用檢測技術(shù)。所建立的鹿茸及鹿血的污染物檢測方法,具有樣品前處理簡單、分析特異性強(qiáng)且靈敏度高的特點(diǎn)。為梅花鹿茸、鹿血產(chǎn)品中主要病原微生物及獸用麻醉藥的殘留檢測供了重要技術(shù)支持,對于鹿茸及鹿血相關(guān)產(chǎn)品的食品安全評估體系的完善和補(bǔ)充有著重要意義。
【學(xué)位授予單位】：吉林農(nóng)業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R284
【圖文】：

圖 2.1 S2 的全基因組.2.1 Complete genome oDL15000 1：基因組 L15000 1：Genomic進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，獲M 1 2pp

圖 2.1 S2 的全基因.2.1 Complete genome DL15000 1：基因組DL15000 1：Genomi果，進(jìn)行 PCR 擴(kuò)增，00bp00bp0bp0bp0bp0bpbpM 1 2

圖 2.3 IS711 重組質(zhì)粒 PCR 擴(kuò)增結(jié)果Fig.2.3 Recombinant plasmid PCR resultsM：DL2000 1：重組質(zhì)粒 2：陰性對照M：DL2000 1：Recombinant plasmid 2：Negative control光定量 PCR 反應(yīng)體系建立規(guī)反應(yīng)體系及條件對 5 個不同初始濃度的標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)粒樣品進(jìn)行反 Ct≤30，可判定為陽性，見圖 2.4。2000bp1000bp750bp500bp250bp100bp

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本文編號：2751841