【摘要】：目的:本課題旨在通過應(yīng)用斑馬魚數(shù)字化藥物篩選平臺,觀察菟絲煎對斑馬魚睡眠晝夜行為學表型的影響,并通過斑馬魚藥效指紋圖譜進行行為學表型比對,探討菟絲煎不同復(fù)方及由復(fù)方拆解的不同藥物組合對于失眠治療的共性作用和差異性的效應(yīng)物質(zhì)基礎(chǔ),以期為中醫(yī)“同病異治”提供客觀依據(jù)。通過聚類分析、相關(guān)性對比分析,探究菟絲煎的組方規(guī)律,同時通過與已知靶點的化合物數(shù)據(jù)庫進行靶點擬合,以探討復(fù)方及單藥的可能作用靶點與作用機制。為處方優(yōu)化及新藥發(fā)現(xiàn)提供理論依據(jù),探索中藥復(fù)方和單藥研究的新途徑。方法:采用斑馬魚藥物篩選平臺,將4Dpf的野生型斑馬魚幼魚用加樣槍逐個加入96孔板中,然后根據(jù)藥物分組每孔用移液槍加入配置好濃度的干預(yù)藥物,空白組加入等量的含甲基藍的Holt Buffer培養(yǎng)液,放置在幼魚觀察行為儀裝置中待觀察。打開與斑馬魚行為記錄儀及恒溫水浴箱,設(shè)置水浴溫度為恒溫28.5攝氏度,設(shè)置好斑馬魚行為記錄儀的相關(guān)參數(shù)后,開始實驗,斑馬魚自動成像系統(tǒng)自動記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。48小時后,實驗結(jié)束,輸出所記錄的數(shù)據(jù),通過R軟件編程處理后得到以六個行為學指標排列的數(shù)據(jù),通過單因素方差分析、聚類分析、相關(guān)分析等數(shù)據(jù)處理方法展現(xiàn)斑馬魚在行為學表型、聚類規(guī)律、相關(guān)性的強弱等分析其可能作用靶點與可能作用機制。結(jié)果:菟絲煎不同劑量及不同藥物組合對斑馬魚六個行為學指標的影響呈現(xiàn)多樣性,但其正常的睡眠/覺醒節(jié)律均存在。聚類分析中菟絲煎低劑量組首先與茯苓遠志棗仁高劑量組聚在一起再與褪黑素組、菟絲煎中劑量與高劑量組、茯苓遠志棗仁低劑量和中劑量組、人參當歸山藥炙甘草中劑量和高劑量組先后聚成一大類。菟絲子鹿角霜高中低劑量組和人參當歸山藥炙甘草低劑量組組成另外的一大類。菟絲煎低劑量組與茯苓遠志棗仁中劑量組、茯苓遠志棗仁高劑量組具有較高相似性;菟絲煎中高劑量組與茯苓遠志棗仁低中高劑量組劑量組、人參當歸山藥炙甘草高劑量組之間具有較高相似性;菟絲子鹿角霜低劑量組與人參當歸山藥炙甘草低劑量組具有較高相似性。劑量相關(guān)性分析顯示,除了菟絲煎中劑量組和高劑量組有較強相關(guān)性外,其余都沒有明顯的相關(guān)性。靶點擬合中復(fù)方及各組方所涉及的神經(jīng)受體主要有7類,分別為腎上腺素受體,五羥色胺受體、多巴胺受體、γ氨基丁酸受體、褪黑素受體、抗組胺受體、谷氨酸受體,所涉及的相似藥物有24種,具有相似性的藥物多具有鎮(zhèn)靜作用,少部分具有雙向調(diào)節(jié)和劑量依賴性。結(jié)論:不同劑量的復(fù)方、藥組及單藥的功效是通過不同靶點綜合作用的結(jié)果,且各復(fù)方及藥組劑量不同其作用的靶點也存在差異,這可能與不同藥物組合煎煮后發(fā)生的有效成分析出的變化有關(guān)。斑馬魚幼魚行為學的多樣性及聚類分析結(jié)果是建立在中藥復(fù)方具有多成分多作用靶點特點的基礎(chǔ)上的。菟絲煎治療失眠的機制可能與其作用于多種具有鎮(zhèn)靜作用生物靶點有關(guān)。菟絲煎低劑量組呈晚上抑制,白天無明顯影響,符合人類晝精夜寐的生物節(jié)律特點,故在臨床上其治療表現(xiàn)為晝不精夜不寐的心脾氣弱型失眠效果良好。
【學位授予單位】：廣州中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285;R-332
【圖文】：

新藥提供極大便利。同時也為中藥復(fù)方的作用機制研究、類方間的作用研究優(yōu)化研究提供了新思路。 斑馬魚行為數(shù)據(jù)的采集與處理逡2.1.1 斑馬魚行為數(shù)據(jù)的采集實驗前打開斑馬魚行為儀和水浴恒溫裝置，設(shè)置水浴溫度為恒溫 28.5 攝氏度與斑馬魚行為記錄儀相連接的電腦，將提前放置好幼魚和藥物的 96 孔板按心放置在幼魚實驗裝置孔板槽內(nèi)，關(guān)上擋板門，點擊行為儀程序圖標，進入板頁面，用鼠標拖動選中所有孔，并雙擊第一個孔進入設(shè)置孔板每孔參數(shù)設(shè)觀測范圍：先設(shè)定左上、右上、右下圓孔然后的點擊（build）按鈕即可建孔的觀測范圍。然后設(shè)定最大運動速度、最小運動速度、設(shè)定最小探測閾值色、最小活動閾值、不動活動閾值；設(shè)置實驗總時間為 48 小時，白晝和黑替參數(shù)：開燈時間（9:00AM）、關(guān)燈時間（23：00PM），光照強度為 70%，每一次數(shù)據(jù)。點擊攝像頭視頻生成按鈕。點擊觀察程序開始（STAR）按鈕，實斑馬魚自動成像系統(tǒng)自動記錄相關(guān)數(shù)據(jù)。48 小時后，點擊（stop）按鈕并輸?shù)臄?shù)據(jù)。

Rest total 黑夜 2.501 0.062Rest total 白天 5.484 0.039Rest bout 黑夜 2.969 0.196Rest bout 白天 14.371 0.000Rest bout length 黑夜 2.236 0.064Rest bout length 白天 1.875 0.114Rest lactency 開燈 0.638 0.672Rest lactency 關(guān)燈 3.689 0.061Activity total 黑夜 1.672 0.157Activity total 白天 3.038 0.017Waking activity 黑夜 1.195 0.324Waking activity 白天 3.512 0.0812.3.3 對有機溶劑影響的觀察由于陽性對照組藥物褪黑素需要溶解在二甲基亞砜（DMSO）中，因此有必要確定DMSO 對斑馬魚幼魚行為學的影響。因此我們做了溶劑的對比試驗，DMSO 濃度設(shè)定為0.3%（參照文獻），結(jié)果表明（圖 2.2）指紋圖譜中各個指標相對距離不超過±1，且折線圖中沒有明顯差異。說明 DMSO 濃度在 0.3%以下對行為學實驗結(jié)果沒有明顯影響。

廣州中醫(yī)藥大學 2018 屆碩士畢業(yè)論文圖2.3對邊沿效應(yīng)的影響觀察指紋圖及折線圖2.3.5 不同批幼魚間的差異性分析由于行為學觀察試驗分批進行，每次試驗所用的斑馬魚幼魚不同，因此我們對不同批次的斑馬魚幼魚的影響進行了行為學試驗，將不同批次（即斑馬魚孵育的日期不是同一天）斑馬魚幼魚的行為學表型進行對比，指紋圖譜中除Rest total第二時段外，各個指標相對距離不超過±1，且折線圖中沒有明顯差異（圖2.4）。說明不同批次的幼魚行為學差異不明顯。圖2.4不同批幼魚間的差異性分析指紋圖及折線圖2.4 藥物劑量的確定選擇中藥復(fù)方及藥物組合的濃度對任何大規(guī)模的未知化合物篩選都是一個挑戰(zhàn)。有效劑量可以在不同的化合物之間變化，但在大多數(shù)情況下，在多個濃度下進行篩選是不切實際的。決定我們的中藥復(fù)方在 1-10 mg·mL-1范圍內(nèi)的是基于以下考慮因素。首先，我們在前期預(yù)實驗中進行了多個濃度梯度的試驗，具體藥物濃度范圍為 0.5-20mg·mL-。第二，這些中藥組方在 15-20 mg·mL-1范圍內(nèi)呈明顯毒性，大部分幼魚（50%以上）多在 24 小時內(nèi)出現(xiàn)死亡

【參考文獻】

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本文編號：2751678