【摘要】：目的:基于“足細(xì)胞損傷是糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)生的關(guān)鍵性病理改變,自噬異常是足細(xì)胞損傷的病理學(xué)基礎(chǔ)”的觀點(diǎn),本研究通過觀察固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞的損傷、凋亡和自噬情況,探討該含藥血清是否及如何調(diào)節(jié)高糖所致的足細(xì)胞自噬異常,維持足細(xì)胞的形態(tài)和數(shù)量,減輕足細(xì)胞損傷,為DN提供新的防治靶點(diǎn)。方法:參照《中藥藥理研究方法學(xué)》的動(dòng)物劑量換算公式,將SD雄性大鼠給予生理鹽水和不同濃度的固本化瘀通絡(luò)合劑灌胃,獲得空白組大鼠血清、2倍等效劑量含藥血清和4倍等效劑量含藥血清。第一部分:取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的足細(xì)胞種植于細(xì)胞培養(yǎng)板中,置37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至分化成熟;將分化成熟的足細(xì)胞隨機(jī)分為正常對(duì)照組(5.5mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)、低濃度含藥血清組(30 mmol/L葡萄糖+2倍等效劑量含藥血清)和高濃度含藥血清組(30 mmol/L葡萄糖+4倍等效劑量含藥血清)。本研究通過觀察24 h、48 h和72 h時(shí)足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化,并結(jié)合CFSE/PI雙染實(shí)驗(yàn)對(duì)細(xì)胞死亡率進(jìn)行檢測(cè),以確定固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下足細(xì)胞的最適作用濃度。第二部分:將細(xì)胞隨機(jī)分為對(duì)照組(5.5 mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)和中藥組(30 mmol/L葡萄糖+2倍等效劑量含藥血清),用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞的凋亡水平,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測(cè)nephrin mRNA表達(dá),蛋白印跡法(Western Blotting,WB)檢測(cè)nephrin蛋白表達(dá)。第三部分:用免疫熒光檢測(cè)不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞的P62/SQSTM1的表達(dá),pGMAD-CMV-RFP-GFP-hLC3腺病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)微管相關(guān)蛋白1的輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3,MAP-LC3或LC3)的表達(dá),RT-qPCR檢測(cè)LC3B、P62、atg5、atg7、atg12、AMPK(AMP-activated protein kinase,腺苷酸活化的蛋白激酶)和mTOR(mammalian target of rapamycin,雷帕霉素靶蛋白)mRNA的相對(duì)表達(dá)量,Western Blotting檢測(cè)LC3-I、LC3-II、P62、Atg7、Atg12-Atg5、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR的蛋白表達(dá)。結(jié)果:第一部分:正常對(duì)照組足細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)于培養(yǎng)孔板底部,細(xì)胞呈樹枝狀或星形;高糖組足細(xì)胞不同程度地出現(xiàn)皺縮,伴有足突變短、融合或消失;與高糖組相比,低濃度含藥血清組的足細(xì)胞形態(tài)有明顯改善,但高濃度含藥血清組的足細(xì)胞足突更加短小,脫落的足細(xì)胞數(shù)量更多。CFSE/PI染色:低濃度含藥血清能減少高糖所致的足細(xì)胞死亡率,而高濃度含藥血清組足細(xì)胞的死亡率比高糖組明顯增加。因此,我們選擇低濃度(2倍等效劑量)含藥血清進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。第二部分:48h和72h時(shí),與對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞凋亡率增高;與高糖組相比,中藥組凋亡率明顯降低。RT-PCR和Western Blotting檢測(cè):在各個(gè)時(shí)間點(diǎn),高糖組足細(xì)胞nephrin mRNA及蛋白表達(dá)量與對(duì)照組相比,均明顯下降;與高糖組相比,中藥組足細(xì)胞nephrin mRNA及蛋白表達(dá)量明顯升高。第三部分:(1)免疫熒光檢測(cè):24h時(shí),高糖組綠色熒光顆粒較對(duì)照組明顯增多,與高糖組相比,中藥組的綠色熒光顆粒有所減少;這種趨勢(shì)在48h和72h時(shí)變得越來(lái)越明顯。(2)腺病毒轉(zhuǎn)染檢測(cè)LC3的表達(dá):與對(duì)照組相比,高糖組足細(xì)胞內(nèi)黃色和紅色熒光顆粒數(shù)量均明顯減少,與高糖組相比,中藥組足細(xì)胞內(nèi)黃色和紅色斑點(diǎn)均明顯增多。(3)RT-PCR檢測(cè)和Western Blotting檢測(cè):在三個(gè)時(shí)間點(diǎn),LC3B、atg5、atg7、atg12、P62和mTOR的mRNA和蛋白、p-AMPK的蛋白相對(duì)表達(dá)量進(jìn)行組內(nèi)比較,均有顯著差異性,但AMPK mRNA和蛋白表達(dá)量、p-mTOR的蛋白表達(dá)量均未見明顯變化。結(jié)論:(1)高糖引起足細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變,誘導(dǎo)足細(xì)胞死亡;低濃度固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清能改善高糖環(huán)境下的足細(xì)胞形態(tài),降低死亡率;高濃度含藥血清對(duì)高糖環(huán)境下的足細(xì)胞未見保護(hù)作用,相反,導(dǎo)致足細(xì)胞死亡率增高。(2)固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清能在一定程度上抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞損傷和凋亡,維持足細(xì)胞的形態(tài)及功能,這可能與其調(diào)節(jié)足細(xì)胞自噬異常有關(guān)。(3)高糖抑制足細(xì)胞自噬活性,固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清可能通過增加p-AMPK水平、降低mTOR的表達(dá),進(jìn)一步調(diào)節(jié)AMPK和mTOR信號(hào)通路,促進(jìn)自噬小體的形成和自噬底物的降解,改善高糖環(huán)境下足細(xì)胞的自噬異常,抑制足細(xì)胞損傷和凋亡,從而發(fā)揮保護(hù)足細(xì)胞的作用。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號(hào)】：R285
【圖文】：

圖 1-1. 不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞的形態(tài)學(xué)改變（ 200）2.2 不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞 CFSE/PI 染色結(jié)果CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯），其含有兩個(gè)乙酸基團(tuán)和一個(gè)功能基團(tuán)，當(dāng)其以此種形式存在時(shí)，不具備熒光性質(zhì)，卻具有高度的膜穿透性而自由進(jìn)入活細(xì)胞；當(dāng)其擴(kuò)散進(jìn)入細(xì)胞后，內(nèi)源性酯酶將乙酸基團(tuán)水解使其具備很高的熒光活性，卻不再具有膜通透性，最終形成具有熒光的蛋白復(fù)合物，在 490 nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光下，分組處理前所有存活細(xì)胞的胞質(zhì)被 CFSE 染色呈現(xiàn)綠色熒光。PI（Propidium Iodide，碘化丙啶），是一種 DNA 熒光染料，其分子量大而不能通過正常細(xì)胞的完整細(xì)胞膜，早期凋

成都中醫(yī)藥大學(xué)博士學(xué)位論文亡的細(xì)胞由于仍然保持著細(xì)胞膜的完整性，因此也無(wú)法被 PI 染色；而晚期凋亡的細(xì)胞和死細(xì)胞的細(xì)胞膜完整性喪失，PI 能穿過破損的細(xì)胞膜將其 DNA 染色，在 536 nm 波長(zhǎng)的激發(fā)光下，凋亡和壞死細(xì)胞的胞核被 PI 染色呈現(xiàn)紅色熒光。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：在細(xì)胞培養(yǎng)的不同時(shí)間點(diǎn)，各組細(xì)胞的綠色熒光強(qiáng)度、數(shù)量及分布情況無(wú)明顯差異。在培養(yǎng) 24h 時(shí)，正常對(duì)照組、高糖組和低濃度含藥血清組細(xì)胞的紅色熒光比例及強(qiáng)度均未見明顯差異，與高糖組和低濃度含藥血清組比較，高濃度含藥血清組的紅色強(qiáng)熒光明顯增多（圖 1-2，表 1-1）。

圖 1-3. 48 h 時(shí)，不同培養(yǎng)條件下足細(xì)胞 CFSE/PI 染色結(jié)果（ 100）注：所有存活細(xì)胞的胞質(zhì)被CFSE染色呈現(xiàn)綠色熒光，凋亡和壞死細(xì)胞的胞核被PI染色呈現(xiàn)紅色熒光。細(xì)胞培養(yǎng) 72 h 時(shí)，不同培養(yǎng)條件下細(xì)胞死亡率的變化趨勢(shì)與 48 h 時(shí)一致（圖 1-4，表 1-3）。結(jié)果說明，培養(yǎng) 48 h 和 72 h 時(shí)，低濃度固本化瘀通絡(luò)合劑含藥血清能降低高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞死亡率，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）；而高濃度含藥血清反而使高糖環(huán)境下的足細(xì)胞死亡率增高（P<0.05）。

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本文編號(hào)：2749491