發(fā)布時間：2020-07-10 21:48

【摘要】：目的:基于“足細胞損傷是糖尿病腎病(Diabetic nephropathy,DN)發(fā)生的關鍵性病理改變,自噬異常是足細胞損傷的病理學基礎”的觀點,本研究通過觀察固本化瘀通絡合劑含藥血清對高糖環(huán)境下足細胞的損傷、凋亡和自噬情況,探討該含藥血清是否及如何調(diào)節(jié)高糖所致的足細胞自噬異常,維持足細胞的形態(tài)和數(shù)量,減輕足細胞損傷,為DN提供新的防治靶點。方法:參照《中藥藥理研究方法學》的動物劑量換算公式,將SD雄性大鼠給予生理鹽水和不同濃度的固本化瘀通絡合劑灌胃,獲得空白組大鼠血清、2倍等效劑量含藥血清和4倍等效劑量含藥血清。第一部分:取對數(shù)生長期的足細胞種植于細胞培養(yǎng)板中,置37℃、5%CO_2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)至分化成熟;將分化成熟的足細胞隨機分為正常對照組(5.5mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)、低濃度含藥血清組(30 mmol/L葡萄糖+2倍等效劑量含藥血清)和高濃度含藥血清組(30 mmol/L葡萄糖+4倍等效劑量含藥血清)。本研究通過觀察24 h、48 h和72 h時足細胞的形態(tài)學變化,并結(jié)合CFSE/PI雙染實驗對細胞死亡率進行檢測,以確定固本化瘀通絡合劑含藥血清對高糖環(huán)境下足細胞的最適作用濃度。第二部分:將細胞隨機分為對照組(5.5 mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)、高糖組(30 mmol/L葡萄糖+空白組大鼠血清)和中藥組(30 mmol/L葡萄糖+2倍等效劑量含藥血清),用流式細胞術(shù)檢測不同培養(yǎng)條件下足細胞的凋亡水平,逆轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(reverse transcription-polymerase chain reaction,RT-qPCR)檢測nephrin mRNA表達,蛋白印跡法(Western Blotting,WB)檢測nephrin蛋白表達。第三部分:用免疫熒光檢測不同培養(yǎng)條件下足細胞的P62/SQSTM1的表達,pGMAD-CMV-RFP-GFP-hLC3腺病毒轉(zhuǎn)染檢測微管相關蛋白1的輕鏈3(microtubule-associated protein1 light chain3,MAP-LC3或LC3)的表達,RT-qPCR檢測LC3B、P62、atg5、atg7、atg12、AMPK(AMP-activated protein kinase,腺苷酸活化的蛋白激酶)和mTOR(mammalian target of rapamycin,雷帕霉素靶蛋白)mRNA的相對表達量,Western Blotting檢測LC3-I、LC3-II、P62、Atg7、Atg12-Atg5、AMPK、p-AMPK、mTOR和p-mTOR的蛋白表達。結(jié)果:第一部分:正常對照組足細胞貼壁生長于培養(yǎng)孔板底部,細胞呈樹枝狀或星形;高糖組足細胞不同程度地出現(xiàn)皺縮,伴有足突變短、融合或消失;與高糖組相比,低濃度含藥血清組的足細胞形態(tài)有明顯改善,但高濃度含藥血清組的足細胞足突更加短小,脫落的足細胞數(shù)量更多。CFSE/PI染色:低濃度含藥血清能減少高糖所致的足細胞死亡率,而高濃度含藥血清組足細胞的死亡率比高糖組明顯增加。因此,我們選擇低濃度(2倍等效劑量)含藥血清進行后續(xù)實驗。第二部分:48h和72h時,與對照組相比,高糖組足細胞凋亡率增高;與高糖組相比,中藥組凋亡率明顯降低。RT-PCR和Western Blotting檢測:在各個時間點,高糖組足細胞nephrin mRNA及蛋白表達量與對照組相比,均明顯下降;與高糖組相比,中藥組足細胞nephrin mRNA及蛋白表達量明顯升高。第三部分:(1)免疫熒光檢測:24h時,高糖組綠色熒光顆粒較對照組明顯增多,與高糖組相比,中藥組的綠色熒光顆粒有所減少;這種趨勢在48h和72h時變得越來越明顯。(2)腺病毒轉(zhuǎn)染檢測LC3的表達:與對照組相比,高糖組足細胞內(nèi)黃色和紅色熒光顆粒數(shù)量均明顯減少,與高糖組相比,中藥組足細胞內(nèi)黃色和紅色斑點均明顯增多。(3)RT-PCR檢測和Western Blotting檢測:在三個時間點,LC3B、atg5、atg7、atg12、P62和mTOR的mRNA和蛋白、p-AMPK的蛋白相對表達量進行組內(nèi)比較,均有顯著差異性,但AMPK mRNA和蛋白表達量、p-mTOR的蛋白表達量均未見明顯變化。結(jié)論:(1)高糖引起足細胞形態(tài)學改變,誘導足細胞死亡;低濃度固本化瘀通絡合劑含藥血清能改善高糖環(huán)境下的足細胞形態(tài),降低死亡率;高濃度含藥血清對高糖環(huán)境下的足細胞未見保護作用,相反,導致足細胞死亡率增高。(2)固本化瘀通絡合劑含藥血清能在一定程度上抑制高糖誘導的足細胞損傷和凋亡,維持足細胞的形態(tài)及功能,這可能與其調(diào)節(jié)足細胞自噬異常有關。(3)高糖抑制足細胞自噬活性,固本化瘀通絡合劑含藥血清可能通過增加p-AMPK水平、降低mTOR的表達,進一步調(diào)節(jié)AMPK和mTOR信號通路,促進自噬小體的形成和自噬底物的降解,改善高糖環(huán)境下足細胞的自噬異常,抑制足細胞損傷和凋亡,從而發(fā)揮保護足細胞的作用。
【學位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

圖 1-1. 不同培養(yǎng)條件下足細胞的形態(tài)學改變（ 200）2.2 不同培養(yǎng)條件下足細胞 CFSE/PI 染色結(jié)果CFSE（carboxyfluorescein succinimidyl amino ester，羧基熒光素二醋酸鹽琥珀酰亞胺酯），其含有兩個乙酸基團和一個功能基團，當其以此種形式存在時，不具備熒光性質(zhì)，卻具有高度的膜穿透性而自由進入活細胞；當其擴散進入細胞后，內(nèi)源性酯酶將乙酸基團水解使其具備很高的熒光活性，卻不再具有膜通透性，最終形成具有熒光的蛋白復合物，在 490 nm 波長的激發(fā)光下，分組處理前所有存活細胞的胞質(zhì)被 CFSE 染色呈現(xiàn)綠色熒光。PI（Propidium Iodide，碘化丙啶），是一種 DNA 熒光染料，其分子量大而不能通過正常細胞的完整細胞膜，早期凋

成都中醫(yī)藥大學博士學位論文亡的細胞由于仍然保持著細胞膜的完整性，因此也無法被 PI 染色；而晚期凋亡的細胞和死細胞的細胞膜完整性喪失，PI 能穿過破損的細胞膜將其 DNA 染色，在 536 nm 波長的激發(fā)光下，凋亡和壞死細胞的胞核被 PI 染色呈現(xiàn)紅色熒光。實驗結(jié)果顯示：在細胞培養(yǎng)的不同時間點，各組細胞的綠色熒光強度、數(shù)量及分布情況無明顯差異。在培養(yǎng) 24h 時，正常對照組、高糖組和低濃度含藥血清組細胞的紅色熒光比例及強度均未見明顯差異，與高糖組和低濃度含藥血清組比較，高濃度含藥血清組的紅色強熒光明顯增多（圖 1-2，表 1-1）。

圖 1-3. 48 h 時，不同培養(yǎng)條件下足細胞 CFSE/PI 染色結(jié)果（ 100）注：所有存活細胞的胞質(zhì)被CFSE染色呈現(xiàn)綠色熒光，凋亡和壞死細胞的胞核被PI染色呈現(xiàn)紅色熒光。細胞培養(yǎng) 72 h 時，不同培養(yǎng)條件下細胞死亡率的變化趨勢與 48 h 時一致（圖 1-4，表 1-3）。結(jié)果說明，培養(yǎng) 48 h 和 72 h 時，低濃度固本化瘀通絡合劑含藥血清能降低高糖誘導的足細胞死亡率，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）；而高濃度含藥血清反而使高糖環(huán)境下的足細胞死亡率增高（P<0.05）。

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