【摘要】：噪聲性聾是由噪聲所誘發(fā)的聽覺系統(tǒng)損傷,也是最常見的職業(yè)性傷害和聽力致殘因素之一。研究認為,噪聲致聾的一個重要機制是耳蝸氧化應激產(chǎn)生了大量活性氧自由基,導致內耳毛細胞的破壞,進而影響了聽覺的傳輸。另一方面,由于線粒體中氧化應激導致氧化呼吸鏈的中斷,使得大量酸性中間代謝產(chǎn)物堆積造成局部酸化。隨著中醫(yī)藥現(xiàn)代化的發(fā)展,傳統(tǒng)中藥復方制劑已無法適應中醫(yī)精準醫(yī)學的理念和發(fā)展,因此,亟待開發(fā)新型復方制劑釋藥系統(tǒng),實現(xiàn)中藥復方制劑現(xiàn)代化。丹參與三七配伍,是臨床上常用的藥對之一,二者中的活性成分均能夠有效清除活性氧自由基,且均能起到預防和治療噪聲性聾的作用。自日本學者首次報道氫氣的抗氧化效果以來,氫氣對內耳疾病及內耳毛細胞的保護作用也得到廣泛研究。目前有研究表明,氫氣可減輕內耳毛細胞的氧化應激,對噪聲性聾具有良好的防治作用。智能響應型釋藥系統(tǒng)以其精準化、個體化的獨特優(yōu)勢,得到了世界范圍內廣泛關注及研究。相比于單一刺激響應性系統(tǒng),針對多種刺激信號的多重響應性系統(tǒng)能夠更為精確地控制藥物的釋放。本課題選擇丹參、三七有效組分(丹參酮IIA、三七皂苷R1、人參皂苷Rb1、人參皂苷Rg1)作為模型藥物,針對噪聲性聾所造成的氧化應激和局部酸化,設計了以pH響應性納米碳酸鈣(CMCS/CC)為藥物載體、以低分子量殼聚糖(CS)為氧化響應性外殼并包載超順磁性納米四氧化三鐵,集pH、氧化、磁響應性于一體的多重響應納米給藥系統(tǒng);同時制備載納米氫化鈣的聚乙二醇單甲醚-聚乳酸共聚物(mPEG-PLGA)納米粒(NPs)以實現(xiàn)氫氣的緩慢持續(xù)性釋放。最后分子對接結果顯示,二者可以通過氫鍵作用相結合,得到三重響應同時具氫氣緩釋能力的中藥多組分復合納米載藥體系。以碳酸鈣(CC)為基質、羧甲基殼聚糖(CMCS)為生物礦化抑制劑,采用生物礦化法構建pH響應內核CMCS/CC�？疾霤MCS不同濃度對CMCS/CC粒徑的影響,隨著CMCS濃度的增加,CMCS/CC體系的平均粒徑隨之增加。X射線衍射分析表明,制備得到的CC主要晶型為方解石,平均粒徑為39.7 nm;掃描電子顯微鏡觀察證實CMCS/CC為CC的聚集,且總體呈現(xiàn)類球形態(tài);N2吸附脫附實驗結果提示CMCS/CC存在37 nm和100 nm左右的單峰,表明CMCS/CC存在多級復孔結構,且通過熒光顯微鏡觀察顯示,CMCS/CC微球對于水溶性的羅丹明B和脂溶性的尼羅紅,均具有很好的包載性能。尼羅紅釋放實驗表明,CMCS/CC的pH響應性能與CMCS的濃度有關,CMCS濃度為1 mg/m L時,不同pH條件下釋藥行為相似;當CMCS濃度增大到3 mg/m L以上時,則表現(xiàn)為pH6.0條件下的釋藥速率最快。通過離子交聯(lián)法制備CS外殼,首先利用CMCS與CS的電荷吸引將CS吸附于CMCS/CC表面,再利用γ-聚谷氨酸(γ-PGA)的交聯(lián)作用,使CS在CMCS/CC表面形成交聯(lián)結構,以形成穩(wěn)定的核殼結構,同時在CS外殼中包載超順磁性納米粒以實現(xiàn)載體磁靶向性,并在其表面配合鐵離子,利用類Fenton反應增強載體的氧化響應性能。粒徑分布顯示,CS濃度在一定范圍內時,粒徑分布相比于CMCS/CC變得更加均一,PDI更小,當CS濃度為10 mg/m L時,PDI可低至0.002±0.10(n=3),說明γ-PGA對CS的交聯(lián)作用,使得作為外殼的CS在CMCS/CC表面更加致密。在CS層包載了超順磁性Fe3O4納米粒后,磁滯回線結果提示CMCS/CC-CS表現(xiàn)出良好的磁響應性能。氧化響應性試驗表明,CMCS/CC-CS在100 mM H2O2(pH5.0和pH6.0)環(huán)境中,尼羅紅在6 h內即可釋放完全;數(shù)學分析表明,100 mM H2O2環(huán)境中,CMCS/CC-CS在pH5.0條件下,滿足一級釋放動力學過程;在pH6.0條件下,滿足Ritger-peppas方程,n=1.33,為super case II轉運,表明藥物的釋放與基質的壓力、親水性玻璃態(tài)聚合物的相轉變或聚合物的解聚、溶蝕有關;在pH7.4條件下,滿足Ritger-peppas方程,n=0.503,表明藥物的釋放同時受到擴散和溶蝕兩種作用的控制,且藥物的擴散占據(jù)主導作用。應用高速機械剪切法制備得到納米氫化鈣,在20,000-30,000 rpm的轉速下高速攪拌1 h后納米氫化鈣平均粒徑在166.4 nm,PDI為0.268。氫氣檢測試液測定氫氣濃度發(fā)現(xiàn),納米氫化鈣可以在較長時間內維持較高的氫氣濃度,在48 h內的氫氣濃度可穩(wěn)定在2.4 ppm以上,具有較長的釋氫時程和較高的釋氫濃度。采用單乳化溶劑揮發(fā)法制備包載納米氫化鈣的mPEG-PLGA NPs,粒徑增大到460.2 nm,PDI為0.229。掃描電子顯微鏡觀察其表面納米形態(tài)呈現(xiàn)規(guī)整的球形,且分散性好。應用分子動力學模擬及分子對接,理論計算出CMCS/CC-CS與mPEG-PLGA NPs之間可以通過氫鍵作用相結合,掃描電子顯微鏡觀察到結合形態(tài)呈“花生”型,并通過FT-IR、XPS等分析手段證實了氫鍵的存在。次級鍵破壞實驗表明,CMCS/CC-CS與mPEG-PLGA NPs結合的主要驅動力為氫鍵作用和(或)疏水作用,靜電力起輔助作用。結構穩(wěn)定性實驗表明,該納米體系在人工內耳外淋巴液中24 h內整體形態(tài)無明顯變化,且豚鼠體內實驗證實其能夠穿過圓窗膜,且在內耳外淋巴中有分布,形態(tài)有略微變化,但雙納米球的結合形態(tài)仍然存在,表明“花生”型納米體系能轉運穿過內耳圓窗膜,并能保持形態(tài)完整。采用共孵育方法制備了載復方丹參三七的納米給藥系統(tǒng)。三七皂苷R1、人參皂苷Rg1、人參皂苷Rb1、和丹參酮IIA的包封率分別為61.93%、63.96%、94.35%和82.41%。綜上,本文研究結果表明,所構建的中藥多組分復合納米載藥系統(tǒng),具有pH、氧化、磁三重響應性能及氫氣緩釋作用,并能夠包載親水及親脂性藥物;對噪聲性聾的預防和治療具有潛在的應用價值,有望成為新型智能響應型中藥復方給藥系統(tǒng)。
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R283.6
【圖文】：

廣東藥科大學碩士研究生學位論文床推廣高壓氧療法，但是此療法僅對輕中度及病程短的噪聲有如基因治療[20]、干細胞移植[21]等新的治療手段，但目前臨床應用，還將面臨諸多困難。雖然噪聲性聾的治療有多特點以及藥物自身諸如穩(wěn)定性、不良反應等缺陷，目前臨床重度噪聲性聾）的治療仍然缺乏確切有效的治療方案。因此策略外，開發(fā)新型智能藥物載體以達到藥物長效、緩釋的目聾的當務之急。

廣東藥科大學碩士研究生學位論文應納米給藥系統(tǒng)[48]。有研究報道了一種基于硫響應納米粒的報道[49]，通過將具結構穩(wěn)定性的疏片段相結合，設計出了 ROS/pH 雙重響應的膠束條件下的表現(xiàn)為疏水性，而在氧化應激條件下則載親水及疏水性藥物。實驗證實，在 H2O2和低蛋白的釋放會因納米粒的降解變得更快。Xu 等物微囊，它具有雙重響應能力：N-異丙基丙烯酰聚 2-乙烯基吡啶作為 pH 響應的臂鏈，單分子膠體，微囊內部可載水溶性大分子，且疏水性和親從殼和核中連續(xù)釋放。并且，這種釋放順序是可按相反的順序釋放。

圖 1-3 納米遞送系統(tǒng)示意圖Fig.1-3 Schematic illustration of the designed NDDS其體內過程推測如下：混合納米給藥系統(tǒng)經(jīng)鼓室注射，并在外加磁場作用下，定向聚集至圓窗膜部位，并經(jīng)圓窗膜進入內耳，噪聲性聾會導致耳蝸內 OS 的發(fā)生，持續(xù)的氧化環(huán)境會導致組織損傷，此時包載氫化鈣納米粒的 mPEG-PLGA 納米粒則會因水的緩慢滲透作用而緩慢釋放氫氣，從而維持環(huán)境中的氧化還原平衡。由于 ROS 的產(chǎn)生部位為線粒體，因此在損傷毛細胞周圍的氧化電位較高且 pH 較低，具 pH/氧化響應性的納米粒則會定向聚集于損傷細胞周圍，并被細胞所吞噬，通常細胞吞噬會形成吞噬小體，最終形成溶酶體將外源性物質降解，但由于 pH 響應性內核基質為碳酸鈣，在溶酶體的酸性環(huán)境中，碳酸鈣被降解，釋放鈣離子，由于鈣離子可破壞溶酶體，因此可促使內核中的抗氧化藥物進行溶酶體逃逸[93]，從而在包漿、線粒體、細胞核等處發(fā)揮直接治療作用。另一方面，由于外殼中納米 Fe3O4的存在，通過核磁共振成像，即可判斷出損傷部位，為進一步治療提供明確方向。

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