【摘要】：目的:紅景天苷(Salidroside,SAL)是植物紅景天(Rhodiola rosea)的主要生物活性成分。已有研究表明紅景天苷可通過改善胰島素抵抗(insulin resistance,IR)而具有治療2型糖尿病(Type 2 Diabetes,T2DM)的作用。腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α,TNF-α)能促進(jìn)棕櫚酸(palmitic acid,PA)跨血管內(nèi)皮細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn),并介導(dǎo)心肌胰島素抵抗。本課題擬研究紅景天苷對TNF-α促PA跨心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞(Cardiac microvascular endothelial cells,CMECs)穿胞(transcytosis)轉(zhuǎn)運(yùn)促發(fā)心肌胰島素抵抗的作用及其機(jī)制。方法:(1)利用脂肪酸體外穿胞模型,檢測紅景天苷、半胱天冬酶caspase-1抑制劑(Ac-YVAD-cmk)對TNF-α促脂肪酸跨微血管內(nèi)皮細(xì)胞穿胞作用的影響。(2)采用蛋白印跡(Western Blotting)方法檢測NLRP3,pro-caspase-1,caspase-1,pro-白介素-1β(pro-Interleukin-1β,pro-IL-1β)及白介素-1β(Interleukin-1β,IL-1β)的表達(dá),考察紅景天苷對TNF-α激活NLRP3炎癥小體的作用。(3)采用2',7'-二氯二氫熒光素二乙酸酯(2',7'-Dichlorodihydrofluorescein diacetate,DCFH-DA)和MitoSOX~(TM) Red熒光探針檢測細(xì)胞內(nèi)活性氧簇(Reactive oxygen species,ROS)和線粒體內(nèi)超氧陰離子水平,考察紅景天苷對TNF-α增加內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激的作用。(4)在原代SD大鼠的乳鼠心肌細(xì)胞和CMECs共培養(yǎng)模型中,檢測在胰島素刺激下,心肌細(xì)胞對2-[N-(7-硝基-2,1,3-苯并惡二唑-4-基氨基)-2-脫氧-D-葡萄糖(2-[N-(7-nitrobenz2-oxa-1,3-diaz-ol-4-ylamino)-2-deoxy-D-glucose,2-NBDG)的攝取;在細(xì)胞水平考察紅景天苷對TNF-α與PA協(xié)同誘導(dǎo)心肌胰島素抵抗的影響。(5)在動物實驗中,采用小動物正電子發(fā)射斷層掃描(Positive emission tomography,PET)檢測胰島素刺激下心臟對~(18)F-2-氟-D-脫氧-葡萄糖(~(18)F-2-fluro-D-deoxy-glucose,~(18)F-FDG)攝取量,計算百分注射劑量率(%ID/cc)。處死小鼠收集心肌組織樣本,使用γ計數(shù)儀直接測定心臟放射值,在整體動物水平上考察紅景天苷對TNF-α與PA協(xié)同誘導(dǎo)心肌胰島素抵抗的影響。結(jié)果:(1)利用脂肪酸穿胞模型可觀察到TNF-α增加脂肪酸跨CMECs的穿胞,紅景天苷可抑制TNF-α促脂肪酸穿胞的作用。半胱天冬酶caspase-1抑制劑(Ac-YVAD-cmk)也可抑制TNF-α促脂肪酸穿胞的作用,而Ac-YVAD-cmk加SAL預(yù)處理與單用Ac-YVAD-cmk相比,在抑制TNF-α促脂肪酸穿胞的作用中沒有顯著差異。(2)Western Blotting結(jié)果顯示,TNF-α可顯著增加NLRP3、pro-caspase-1、caspase-1和IL-1β的表達(dá),而紅景天苷可顯著抑制TNF-α引起NLRP3、IL-1β的表達(dá)。(3)通過使用DCFH-DA熒光探針,TNF-α可導(dǎo)致CMECs內(nèi)ROS水平時間依賴性的升高;而紅景天苷可抑制TNF-α引起的內(nèi)皮細(xì)胞中ROS水平的升高。使用MitoSOX~(TM) Red熒光探針檢測CMECs線粒體超氧陰離子水平,發(fā)現(xiàn)類似現(xiàn)象,即隨著TNF-α孵育時間的延長,線粒體超氧陰離子水平不斷升高;紅景天苷對此也有抑制作用。(4)CMECs-心肌細(xì)胞共培養(yǎng)實驗中,TNF-α與PA共孵育CMECs加重了心肌細(xì)胞胰島素抵抗,而紅景天苷預(yù)處理可顯著減弱這一作用。(5)小動物PET結(jié)果顯示,TNF-α+PA組小鼠胰島素刺激的心臟~(18)F-FDG攝取明顯減少,而紅景天苷預(yù)處理可改善TNF-α+PA引起的胰島素刺激心臟~(18)F-FDG攝取的降低。心臟組織γ計數(shù)檢測的結(jié)果與PET掃描結(jié)果一致。結(jié)論:TNF-α可引起CMECs細(xì)胞內(nèi)ROS和線粒體內(nèi)超氧陰離子水平的上調(diào)及NLRP3炎癥小體的激活,NLRP3炎癥小體的激活參與了TNF-α促進(jìn)PA在心肌微血管內(nèi)皮細(xì)胞的穿胞轉(zhuǎn)運(yùn),進(jìn)而加重PA所引起的心肌細(xì)胞胰島素抵抗的作用。而紅景天苷可能通過降低TNF-α引起的氧化應(yīng)激增加和NLRP3激活,發(fā)揮抑制TNF-α促脂肪酸穿胞及誘發(fā)胰島素抵抗的作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2739329