【摘要】：中藥作為中華民族的瑰寶,已有數(shù)千年的歷史,是我國傳統(tǒng)醫(yī)藥的重要組成部分。隨著中醫(yī)藥事業(yè)的蓬勃發(fā)展,世界各國對中藥的認可程度逐漸增加,中藥已開啟國際化進程。與此同時,人們對中藥的安全性問題也愈來愈關注。其中,中藥中的農藥殘留影響著中藥的療效和安全性,進而影響了中藥貿易以及中醫(yī)藥事業(yè)的發(fā)展,削弱了中藥在國際市場中的競爭力。因此,建立和發(fā)展靈敏、簡單、快速以及低成本的農藥殘留檢測方法,對于確保中藥質量安全,保障人類生命健康,促進中藥走向國際化均具有深遠而重要的現(xiàn)實意義。稀土摻雜上轉換納米材料(upconversion nanoparticles,UCNPs)是一種在長波長(通常是近紅外光或者紅外光)吸收低能光子激發(fā)后,發(fā)射短波長(紫外光或者可見光)高能光子的無機納米熒光材料。與傳統(tǒng)的熒光(fluorescence,FL)探針相比,UCNPs具有諸多獨特的優(yōu)點,如良好的光學和化學穩(wěn)定性,較強的抗光漂白能力和低毒性。此外,由于UCNPs被近紅外光激發(fā),因而具有背景熒光干擾較小,靈敏度和信噪比較高等優(yōu)點。目前,UCNPs在生物醫(yī)學領域受到了廣泛關注,在生物傳感、藥物遞送、生物成像等方面具有較大的應用潛力。本研究基于UCNPs獨特的光學性能,以及光誘導電子轉移(photoinduced electron transfer,PET)、熒光共振能量轉移(fluorescence resonance energy transfer,FRET)等原理,設計并合成了兩種用于中藥中農藥殘留檢測的熒光上轉換納米材料。具體研究內容如下:1.基于酪氨酸酶誘導的光誘導電子轉移構建熒光分析法檢測有機磷農藥本研究采用多巴胺功能化的UCNPs作為FL信號探針,構建酪氨酸酶誘導的PET體系,用于檢測中藥中的有機磷農藥殘留。在酪氨酸酶的催化下,UCNPs表面的多巴胺被氧化為多巴醌�；赑ET效應,UCNPs表面的多巴醌猝滅UCNPs的FL。而有機磷農藥可抑制酪氨酸酶活性,從而阻礙多巴醌的形成,UCNPs的FL信號得以恢復,因而可以定量檢測有機磷農藥。本方法以毒死蜱作為模式待檢物。研究結果表明,毒死蜱的檢測范圍為1.0-1000?ng?mL~(-1),檢測限為0.38 ng?mL~(-1)(3σ)。其他種類農藥和樣品基質對該方法幾乎沒有干擾,表明該方法具有良好的特異性。用于桔梗和當歸的加標樣品檢測,回收率為95.4%-120.0%。本方法具有成本低廉,靈敏度高,無自發(fā)熒光干擾和抗光漂白等優(yōu)點,在實際應用中具有良好的分析性能。2.基于熒光共振能量轉移構建免標記熒光分析法檢測含氰基農藥本研究以UCNPs為能量供體,金納米粒子(Au nanoparticles,AuNPs)為能量受體,建立了一種基于FRET的FL分析法,并將其用于檢測含氰基農藥。將帶負電的AuNPs與帶正電荷的氨基化UCNPs混合,AuNPs可以通過靜電作用吸附到UCNPs的表面上,兩者之間發(fā)生FRET,UCNPs的FL信號猝滅。加入含氰基農藥后,農藥的氰基可以通過Au-N=C金屬-配體配位吸附在AuNPs的表面,取代AuNPs表面上的檸檬酸根離子并誘導AuNPs的聚集,從而阻礙FRET,UCNPs的FL信號得以恢復,由此可對含氰基農藥進行檢測。本方法以啶蟲脒、甲氰菊酯和百菌清作為模式待檢物。研究結果表明,啶蟲脒、甲氰菊酯和百菌清的檢測范圍分別為0.1-100?ng?mL~(-1)、1.0-100?ng?mL~(-1)和0.1-50?ng?mL~(-1),檢測限分別為0.015ng?mL~(-1)、0.24 ng?mL~(-1)和0.011 ng?mL~(-1)(3σ)。整個檢測過程可在6分鐘內完成。該方法無需采用任何標記技術,具有操作簡單,檢測快速,靈敏度高以及成本低等諸多優(yōu)點,而且可以作為一種通用平臺用于含氰基農藥的檢測。該方法已成功用于黨參、白芷和黃芪中啶蟲脒的檢測,回收率為76.0%-120.0%,具有較大的應用潛力。綜上所述,本論文利用UCNPs的反斯托克斯光學特性,設計并合成了兩種UCNPs用于中藥中農藥殘留檢測。相比于傳統(tǒng)的FL探針,UCNPs具有較大的反斯托克斯位移和較強的光穩(wěn)定性�；赨CNPs構建的FL分析方法無自發(fā)熒光干擾,并具有良好的抗光漂白能力。另外,本研究設計的方法結合PET、FRET、酶抑制等策略,具有成本低廉,操作簡單,靈敏度高和重現(xiàn)性好等優(yōu)點,為保障中藥質量安全提供了分析技術支持。
【學位授予單位】：西南大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R284.1;TB383.1
【圖文】：

圖 1-1 以 AuNPs 為信號探針的比色適配體傳感器38Fig. 1-1 A colorimetric aptasensor using AuNPs as probes.38如圖 1-1 所示，Bala 等38使用帶負電荷的金納米粒子（Aunanoparticles，AuNPs）和帶正電荷的聚二甲基二烯丙基氯化銨，構建了一種比色適配體傳感器用于馬拉硫磷的檢測。當體系中不存在馬拉硫磷時，游離的帶負電荷的適配體與帶正電荷的聚二甲基二烯丙基氯化銨雜交形成雙鏈體，AuNPs 處于分散狀態(tài)；然而，當體系中存在馬拉硫磷時，適配體特異性地與馬拉硫磷結合，游離的帶正電荷的聚二甲基二烯丙基氯化銨與帶負電荷的 AuNPs 通過靜電作用結合，導致 AuNPs 聚集。因此，可以肉眼觀察 AuNPs 的顏色變化，實現(xiàn)對馬拉硫磷的比色測定。基于乙酰膽堿酯酶（acetylcholinesterase，AChE）的酶促作用以及有機磷農藥（organophosphoruspesticides，OPs）對 AChE 活性的抑制作用，He 等39采用原位生長策略合成了具有過氧化氫酶活性的 AuNPs/金屬有機凝膠雜化物，并將其用于 OPs 的定量檢測。AChE 催化氯化硫代乙酰膽堿水解原位產生的硫代膽堿可以消耗羧基化石墨氮化碳-聚乙烯亞胺的共反應劑，Wang 等40通過酰胺化反應制備了羧基化石墨氮化碳-

游離的 QDs 的 FL 保持不變。然而，當待檢物馬拉硫磷存在時，適配體與馬拉硫磷特異性地結合，帶正電荷的聚-N-3-胍基丙基甲基丙烯酰胺則與帶負電荷的 QDs 通過靜電作用結合，導致 QDs 的 FL 信號猝滅。如圖 1-2 所示，MnO2納米片可以通過熒光共振能量轉移（fluorescenceresonanceenergytransfer，F(xiàn)RET）猝滅碳點（carbondots，CDs）的 FL，丁酰膽堿酯酶催化水解乙酰硫代膽堿產生的硫代膽堿可以有效地引發(fā) MnO2納米片的分解，使得 CDs 的 FL 信號恢復。而 OPs 可以抑制丁酰膽堿酯酶的活性，減少硫代膽堿的生成，導致 CDs 的 FL 信號猝滅�；诖爽F(xiàn)象，Yan 等43構建了一種 FL 分析法用于靈敏檢測 OPs。甲基對硫磷在堿性條件下水解產生的對硝基苯酚可通過內濾效應（inner filter effect，IFE）猝滅 CDs的 FL，Lan 等44使用氮摻雜的 CDs 作為信號探針，建立了一種 FL 分析法用于檢測甲基對硫磷。然而，在上述的 FL 分析法中，復雜的樣品基質在紫外可見光的激發(fā)下，可能會產生自發(fā)熒光干擾，背景熒光信號較高，從而降低檢測的靈敏度。因此，科研工作者開始尋求性能更優(yōu)的納米材料，稀土摻雜上轉換納米材料（upconversionnanoparticles，UCNPs）作為一種新型上轉換發(fā)光材料得到了廣泛的關注。

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