發(fā)布時間：2020-06-29 08:45

【摘要】：克羅恩病(CD)是臨床難治性疾病之一。研究表明,NF-κB信號通路調(diào)控炎癥細(xì)胞因子的釋放是CD發(fā)生的關(guān)鍵機(jī)制和重要的治療靶點,自噬是細(xì)胞新陳代謝的一個重要過程,而通過對自噬通路的調(diào)控達(dá)到改善CD進(jìn)程也是目前研究的熱點,和炎癥相關(guān)的的NF-κB信號通路證實和自噬相關(guān),在CD發(fā)病過程中具有重要作用,中醫(yī)藥在CD治療中有獨特療效,本研究在進(jìn)一步明確黃蜀葵花總黃酮(TFA)治療CD療效的同時,對其治療機(jī)制進(jìn)行探討。目的:1.在動物水平,觀察TFA對CD模型小鼠結(jié)腸炎癥的改善,對炎癥因子TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17表達(dá)量的影響,結(jié)腸組織自噬體的變化及自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62,NF-κB通路標(biāo)志蛋白p-IKKα/β/γ、IκBα p-p65、p100、p52蛋白表達(dá)量的影響。2.在細(xì)胞水平,探討TFA通過對NF-κB自噬通路的調(diào)控,對于RAW264.7細(xì)胞自噬水平的影響及對NF-κB信號通路的影響。方法:1.通過TNBS建立CD小鼠模型,通過對各組小鼠一般情況,DAI評分,鏡下病理評分和Mαsson染色等評估各組小鼠結(jié)腸組織炎癥水平及腸纖維化水平,運用ELISA檢測TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17含量。2.運用透射電鏡觀察結(jié)腸組織中自噬體的變化,Western-Blot、免疫熒光等方法觀察小鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62,NF-κB通路標(biāo)志蛋白p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白表達(dá)量。3.采用體外培養(yǎng)的RAW264.7細(xì)胞,通過CCK-8實驗篩選出不同濃度TFA對LPS刺激的RAW264.7細(xì)胞進(jìn)行干預(yù),并加入通路抑制劑PDTC,采用ELISA檢測體外實驗中各組細(xì)胞TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17含量,Western-Blot、免疫熒光等方法觀察小鼠結(jié)腸組織自噬相關(guān)蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1、p62,NF-κB通路標(biāo)志蛋白p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白表達(dá)量。結(jié)果:1.TNBS誘導(dǎo)CD小鼠相比較正常對照組,小鼠死亡率、結(jié)腸重量/長度比升高,小鼠體重,DAI評分顯著下降,病理評分、纖維化評分顯著升高,結(jié)腸組織中TNF-α、IFN-γ、IL-6、IL-1β、IL-12和IL-17等促炎細(xì)胞因子含量升高(P0.05);和模型組比較,SASP組和TFA各劑量組小鼠死亡率、結(jié)腸重量/長度比均降低,DAI評分、體重均升高,病理、纖維化評分均下降(P0.05),TNF-α,IFN-γ,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17等促炎細(xì)胞因子含量升高(P0.05)。其中,小鼠死亡率的減少、體重的增加、結(jié)腸重量/長度比值的降低程度、結(jié)腸組織TNF-α,IFN-γγ,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17表達(dá)量和TFA呈劑量依賴關(guān)系。2.和正常對照組相比,CD模型小鼠結(jié)腸組織p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白含量升高,p100、p52含量降低,透射電鏡下結(jié)腸組織雙層膜囊泡結(jié)構(gòu)的自噬體減少,標(biāo)志性蛋白LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1降低、p62升高(P0.05)。和模型組比較,SASP組、TFA各劑量組小鼠結(jié)腸組織中p-IKKα/β/γ、IκB、p65、p100、p52蛋白含量降低,p100、p52含量升高,透射電鏡下自噬體增多,LC3-Ⅱ/LC3-Ⅰ、Beclin-1含量增加,p62含量減少(P0.05),且各組變化程度和TFA呈劑量依賴關(guān)系。3.使用CCK-8測定評估TFA毒性,TFA在200μg/mL的劑量下沒有細(xì)胞毒性,LPS顯著促進(jìn)RAW264.7中炎癥細(xì)胞因子水平,包括TNF-α,IFN-y,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17較正常組均升高(P0.05)。SASP、TFA降低了LPS誘導(dǎo)的巨噬細(xì)胞RAW264.7細(xì)胞中炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生。和正常組比較,LPS處理后p-IKKα/β/γ,IκBα和p-p65的表達(dá)顯著增加,p100、p52表達(dá)量下降(P0.05);和LPS組相比,LPS+TFA組、LPS+PDTC組、LPS+TFA+PDTC組p-IKKα/β3/y,IκBα和p-p65表達(dá)量均下降,p100、p52表達(dá)量均上升(P0.05);和LPS+TFA組相比,LPS+PDTC組、LPS+TFA+PDTC組p-IKKα/β/γ,IκBα和p-p65表達(dá)量均有升高,p100、p52表達(dá)量均下降(P0.05);和LPS+PDTC組相比,LPS+TFA+PDTC組p-IKKα/β/γ、IκBα、p-p65、p100、p52表達(dá)量未見明顯變化。4.LPS刺激RAW264.7后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1較正常組顯著減少,p62顯著增加(P0.05);在LPS刺激基礎(chǔ)上,予TFA干預(yù)后發(fā)現(xiàn)LC3 Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1顯著增加,p62顯著下降(P0.05);給予LPS和PDTC刺激后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1較LPS+TFA組、LPS組顯著下降,p62較LPS+TFA組、LPS組顯著升高(P0.05);同時給予LPS、TFA、PDTC后LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、beclin-1相較于LPS組、LPS+TFA組顯著減少(P0.05),p62較LPS組、LPS+TFA組顯著升高;LPS+TFA+PDTC組和LPS+PDTC組間未見明顯差異。結(jié)論:1.TFA具有降低CD模型小鼠結(jié)腸組織和血清中TNF-α,IFN-y,IL-6,IL-1β,IL-12和IL-17炎癥因子含量,減輕CD小鼠臨床癥狀,改善其腸道炎癥程度,且和TFA呈劑量依賴關(guān)系。2.TFA能夠抑制NF-κB通路相關(guān)蛋白表達(dá),激活CD模型小鼠結(jié)腸自噬表達(dá),增加自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白表達(dá)水平。3.NF-κB通路對RAW264.7細(xì)胞的自噬水平具有抑制作用,TFA可能通過抑制NF-κB信號通路傳導(dǎo)激活自噬達(dá)到緩解巨噬細(xì)胞炎癥的作用。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5
【圖文】：

發(fā)生發(fā)展提供新的解釋機(jī)制，ｍＴＯＲ抑制劑可能為炎癥性腸病的治療提供新思路。逡逑（３）邋ＰＩ３Ｋ７Ａｋｔ：邋ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ存在于許多細(xì)胞的代謝中，同時有關(guān)鍵功效，ＰＩ３Ｋ／Ａｋｔ信逡逑號傳導(dǎo)通道被激活，從而調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖，分化，凋亡和自噻１７２］。其激活途徑如

逑據(jù)膠原面積比例，測定得出百分比，依據(jù)鏡下表現(xiàn)評估出纖維化指數(shù)逡逑圖２．４纖維化指數(shù)評分步驟逡逑纖維化指數(shù)標(biāo)準(zhǔn)如表２．３所示。逡逑邐表２．３纖維化指數(shù)評分標(biāo)準(zhǔn)邐逡逑邐＃１邐得分逡逑未見纖維化邐０逡逑黏膜及黏膜下見膠原沉積，但未見結(jié)構(gòu)變形邐１逡逑黏膜及黏膜下見較多膠原沉積，伴輕度組織結(jié)構(gòu)改變，但未見黏膜及黏膜下邐２逡逑界消失逡逑黏膜及黏膜下見大量膠原沉積，伴組織結(jié)構(gòu)扭曲及界限消失邐３逡逑２．５．７邋Ｅｌｉｓａ方法檢測小鼠結(jié)腸組織及血清中炎癥相關(guān)細(xì)胞因子逡逑２．５．７．１邋試齊ｉｊ逡逑（１）將５０ｍＬ２0ｘＷａｓｈ邋Ｂｕｆｆｅｒ溶液加到１０００ｍｌ的量筒中，再慢慢注入去離子水直至逡逑１０００ｍｌ，輕輕搖晃使其能夠均R諍�，转旨Z刪徊Ａ坷錚

本文編號：2733671