【摘要】：目的采用臍靜脈血管內(nèi)皮融合細(xì)胞EA.hy926作為毒性研究評(píng)價(jià)模型,觀察大氣污染細(xì)顆粒物PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響。研究PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性作用,揭示PM2.5引起血管內(nèi)皮細(xì)胞損傷凋亡的可能原因;觀察丹參酮IIA磺酸鈉(STS)對(duì)PM2.5誘導(dǎo)的血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激凋亡的影響作用,從其對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的直接影響探討傳統(tǒng)中醫(yī)藥丹參酮IIA對(duì)其的保護(hù)作用機(jī)制。方法1)PM2.5染毒后EA.hy926細(xì)胞活性的檢測(cè)取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期、生存狀態(tài)良好的EA.hy926細(xì)胞,以8×10~3每孔接種于96孔板,分為對(duì)照組和不同濃度PM2.5染毒組(PM2.5終濃度分別為12.5、25、50、100和200μg/m L),每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔。根據(jù)實(shí)驗(yàn)分組,對(duì)細(xì)胞進(jìn)行染毒,24 h后按照CCK-8試劑盒說明書,10μmol/孔避光加入試劑,培養(yǎng)箱培養(yǎng)2 h,用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值,按公式計(jì)算細(xì)胞存活率和半數(shù)致死量,以確定后續(xù)實(shí)驗(yàn)濃度。細(xì)胞存活率(of control%)=染毒組OD值/對(duì)照組OD值平均值×100%。2)PM2.5染毒后細(xì)胞內(nèi)氧自由基的檢測(cè)將細(xì)胞分為對(duì)照組、不同濃度PM2.5染毒組(PM2.5濃度根據(jù)細(xì)胞存活率及半數(shù)致死量結(jié)果選擇25、50和100μg/mL)和N-乙酰半胱氨酸(N-acetyl-L-cysteine,NAC)處理組(以NAC 10 mmol/mL預(yù)處理1 h后加入PM2.5 100μg/m L)培養(yǎng)至貼壁。細(xì)胞以1×106每孔接種于6孔板,分組和處理同上,24 h后去除培養(yǎng)基,加入DCFH-DA探針(10μmol/L)孵育90 min,用溫PBS漂洗2次,然后用溫?zé)o血清培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)30 min,置于熒光顯微鏡下觀察拍照。3)PM2.5染毒后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡細(xì)胞分組和處理同上,孵育24 h后用無EDTA胰酶消化細(xì)胞,冷PBS離心洗滌2次,然后用400μLBinding Buffer重懸細(xì)胞,先加入Annexin V-FITC 5μL 4℃避光孵育15 min,再加入碘化丙啶(PI)10μL4℃避光孵育5 min后,用流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況。4)PM2.5染毒后細(xì)胞凋亡相關(guān)信號(hào)分子的檢測(cè)細(xì)胞分組和處理同上,24 h后用冷PBS洗滌3次,用含PMSF的RIPA細(xì)胞裂解液冰上裂解細(xì)胞30 min,然后4℃、12500 g離心5 min,收集上清液,用BCA法測(cè)量蛋白濃度。取30μg蛋白進(jìn)行SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜和Western blot。Western blot主要步驟如下:5%脫脂牛奶室溫封閉1 h,TBST清洗10 min×3次,加入相應(yīng)一抗(1:1000),4℃孵育過夜,TBST清洗后加入酶標(biāo)二抗(1:3000),室溫孵育1 h,最后用TBST清洗并用ECL法顯色,凝膠成像系統(tǒng)拍照,用Image-J分析軟件分析條帶的灰度值,用目標(biāo)蛋白與β-actin灰度值的比值來表示蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。5)STS對(duì)細(xì)胞活性的影響取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的EA.hy926細(xì)胞,以8×10~3/孔接種96孔板,分為對(duì)照組、PM2.5 100μg/m L組和不同濃度STS組(終質(zhì)量濃度分別為12.5、25、50μg/m L的STS預(yù)處理2 h后加入PM2.5 100μg/mL),每組5個(gè)復(fù)孔。細(xì)胞按照分組給予不同處理,24 h后參考CCK-8試劑盒說明書進(jìn)行處理,用酶標(biāo)儀在450 nm處檢測(cè)各孔吸光度值(A),按公式計(jì)算細(xì)胞存活率。細(xì)胞存活率=加藥組吸光度值/陰性對(duì)照組吸光度值×100%。6)STS對(duì)染毒PM2.5 EA.hy926細(xì)胞氧化應(yīng)激和凋亡的影響細(xì)胞分組和處理同上,孵育24 h后去除培養(yǎng)基,采用DCFH-DA熒光探針法監(jiān)測(cè)PM2.5刺激24 h后EA.hy926細(xì)胞ROS生成情況;采用FITC/PI雙染監(jiān)測(cè)細(xì)胞的凋亡情況;采用Western Blot法監(jiān)測(cè)PM2.5作用24小時(shí)后EA.hy926細(xì)胞相關(guān)凋亡蛋白Caspase-9、Caspase-3的蛋白表達(dá)情況。結(jié)果1)PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞的毒性作用當(dāng)PM2.5濃度為12.5μg/mL時(shí),EA.hy926細(xì)胞的存活率雖然有所降低,但與對(duì)照組無顯著性差異;當(dāng)PM2.5濃度大于25μg/mL時(shí),EA.hy926細(xì)胞存活率明顯下降,與對(duì)照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性。2)PM2.5對(duì)EA.hy926細(xì)胞氧化損傷的作用熒光染色結(jié)果顯示,相比對(duì)照組細(xì)胞,PM2.5刺激后細(xì)胞內(nèi)可見較強(qiáng)的熒光,且隨著PM2.5濃度的增大熒光強(qiáng)度逐漸增加。以抗氧化劑NAC預(yù)處理后細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度明顯減弱,說明NAC可減少PM2.5誘導(dǎo)的ROS生成。3)染毒后流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡檢測(cè)結(jié)果顯示PM2.5作用于EA.hy926細(xì)胞后,凋亡細(xì)胞數(shù)增多,并呈濃度依賴性增加;實(shí)驗(yàn)還顯示用NAC預(yù)處理后再給予PM2.5染毒可以減輕細(xì)胞凋亡,與對(duì)應(yīng)濃度的PM2.5組比較細(xì)胞凋亡率明顯下降。4)PM2.5對(duì)相關(guān)凋亡相關(guān)信號(hào)分子的影響與對(duì)照組相比,PM2.5可使EA.hy926細(xì)胞胞漿中的Cyt-C含量明顯增高,同時(shí)活化的caspase-3、caspase-9增加,用NAC干預(yù)后Cyt-C蛋白表達(dá)明顯降低,同時(shí)活化的caspase-3、caspase-9表達(dá)降低,說明NAC可下調(diào)凋亡蛋白表達(dá)。5)STS對(duì)細(xì)胞活性的影響100μg/mLPM2.5染毒可使EA.hy926細(xì)胞活性明顯下降,與對(duì)照組有顯著性差異。而STS組細(xì)胞活性較PM2.5組顯著增高,說明STS預(yù)處理可以減輕PM2.5對(duì)血管內(nèi)皮細(xì)胞的毒性。6)STS對(duì)染毒PM2.5 EA.hy926細(xì)胞氧化損傷和凋亡的影響熒光染色結(jié)果顯示,經(jīng)PM2.5刺激后熒光強(qiáng)度明顯增強(qiáng);在不同濃度STS組中,細(xì)胞內(nèi)的熒光強(qiáng)度較PM2.5組明顯降低;流式細(xì)胞儀檢測(cè)顯示與對(duì)照組比較,PM2.5染毒后EA.hy926凋亡率明顯增加,而加入STS預(yù)處理后再給予PM2.5染毒則血管內(nèi)皮細(xì)胞的凋亡率顯著降低,與PM2.5陽性對(duì)照組比較P0.5;PM2.5作用于EA.hy926細(xì)胞后,活化的Caspase-9和Caspase-3增加;用STS預(yù)處理可以抑制PM2.5引起的Caspase-9和Caspase-3激活。結(jié)論:1)PM2.5染毒可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞氧化應(yīng)激水平增強(qiáng)和凋亡增加,這可能是其影響心血管系統(tǒng)功能的機(jī)制之一。2)丹參酮IIA磺酸鈉可以減少PM2.5引起的血管內(nèi)皮細(xì)胞凋亡,其保護(hù)作用可能與抑制氧自由基生成有關(guān)。
【學(xué)位授予單位】：廣東藥科大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：

廣東藥科大學(xué)碩士研究生學(xué)位論文分析系統(tǒng)進(jìn)行拍照，用凝膠圖像處理系統(tǒng)對(duì)目的條帶的分子量以及凈說明書進(jìn)行分析。 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 以 Graphpad Prism 5.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，數(shù)據(jù)以 X±SD）表示，多樣本組間比較采用單因素方差分析（One-Way A計(jì)分析，P<0.05 時(shí)被認(rèn)為具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。 結(jié)果1 PM2.5 對(duì) EA.hy926 的毒性作用圖一可見，隨著 PM2.5 濃度的逐漸增大，EA.hy926 細(xì)胞的存活率依.5 濃度為 12.5 μg/mL 時(shí)，細(xì)胞的存活率雖然有所降低，但與對(duì)照組異；當(dāng) PM2.5 濃度大于 25 μg/mL 時(shí)，EA.hy926 細(xì)胞存活率明顯下降有統(tǒng)計(jì)學(xué)顯著性差異。（見圖 1）

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2730464