【摘要】：多酚是一種重要的植物次生代謝物,在水果、蔬菜等植物性食物中大量存在,植物多酚對糖代謝的積極干預作用已經(jīng)受到國內(nèi)外的廣泛關注。我國蠶桑產(chǎn)業(yè)體量居世界首位,豐富的桑葉資源主要用于養(yǎng)蠶農(nóng)業(yè)生產(chǎn),其重要的食用和藥用價值未得到充分利用與開發(fā)。現(xiàn)代藥理學研究已證實了桑葉多酚輔助降血糖的生物活性,但大部分研究均以桑葉粗提物為原料,且桑葉多酚降血糖的分子機制研究結果不盡統(tǒng)一。因此,本研究在分析6個代表性桑品種桑葉酚類單體組成的基礎上,利用大孔吸附樹脂建立了桑葉多酚富集工藝條件,制備桑葉多酚精制物。以碳水化合物消化吸收的關鍵酶-二糖酶為研究對象,探究桑葉多酚對不同來源二糖酶的抑制作用,并且通過建立Caco-2單層細胞腸道吸收模型來探究其對葡萄糖轉運的影響并初步探討其作用機制。1、不同桑品種的桑葉總多酚及單體酚類物質(zhì)分析。通過高效液相色譜外標法,系統(tǒng)分析并比較了大10、抗青10號、阿2、69、農(nóng)桑14、粵桑11號6個品種桑葉的多酚單體。結果發(fā)現(xiàn),6個品種的桑葉均檢測到綠原酸、香草酸等12種酚類單體,僅阿2檢測到?jīng)]食子酸,不同品種桑葉酚類單體組成差異明顯。按各品種單體酚含量總和計,多酚含量由高至低排列順序為:阿269抗青10號大10農(nóng)桑14粵桑11,由于阿2和69均不是生產(chǎn)上廣泛栽培的品種,產(chǎn)量有限,因此選擇生產(chǎn)用品種抗青10號進行后續(xù)實驗。2、桑葉多酚富集工藝優(yōu)化。以桑葉多酚富集效果為考查指標,篩選出吸附和解吸能力最佳的D101型樹脂,建立了分離純化桑葉多酚的最佳工藝:進料液多酚濃度1mg/mL、pH 3.0、上樣流速1 mL/min、上樣量11BV,吸附結束后,先采用1 BV10%的乙醇進行部分去雜,然后分別用3 BV30%乙醇和3 BV50%的乙醇以1 mL/min的流速洗脫收集。純化后,總酚純度由純化前的20.03%提高到75.67%。3、桑葉多酚對二糖酶的抑制作用。桑葉多酚對小鼠來源和Caco-2細胞來源的二糖酶均具有強烈的抑制作用,且隨著桑葉多酚濃度的增加,抑制作用逐漸增強,其半數(shù)抑制濃度IC50值排序順序為:鼠源蔗糖酶鼠源麥芽糖酶Caco-2細胞麥芽糖酶Caco-2細胞蔗糖酶,桑葉多酚對Caco-2細胞上蔗糖酶的抑制作用最強。對小鼠來源的酶,桑葉多酚對麥芽糖酶的抑制作用更強,即主要是通過抑制麥芽糖酶活性而起到改善血糖的作用;對來自Caco-2細胞的酶,桑葉多酚對蔗糖酶的抑制作用更強,即主要是通過抑制蔗糖酶活性而起到改善血糖的作用。4、桑葉多酚對Caco-2細胞葡萄糖轉運的影響。通過建立Caco-2單層細胞模型模擬人體小腸對葡萄糖的轉運,結果發(fā)現(xiàn),在0.5-2 mg/mL濃度范圍內(nèi),桑葉多酚能夠顯著抑制葡萄糖的轉運,并且隨著孵育時間的延長和多酚濃度的增大,其抑制率也增大。根皮苷(SGLT1抑制劑)對照組對葡萄糖轉運的影響也呈現(xiàn)同樣的趨勢,這揭示了桑葉多酚可能主要是通過抑制SGLT1從而發(fā)揮抑制葡萄糖轉運的作用。熒光定量PCR結果顯示:桑葉多酚對SGLT1、GLUT2、PLC、PKA、PKC的基因表達均呈現(xiàn)抑制作用。在基因水平上推測其可能的信號通路為:桑葉多酚通過下調(diào)PLC和PKA的表達,PLC進而下調(diào)PKC的表達,PKC和PKA共同下調(diào)SGLT1的表達,PKC激活GLUT2轉移至頂膜發(fā)揮葡萄糖轉運的作用也降低,從而降低機體對葡萄糖的吸收。
【學位授予單位】：廣東海洋大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：S888.2;R285
【圖文】：

1.1 植物多酚的種類和分布多酚是植物中分布廣泛、種類繁多的代謝產(chǎn)物，基本化學結構特征是苯酚與一個或多個羥基基團相連形成的共軛結構。已經(jīng)報道的植物多酚類化合物種類繁多，從簡單的小分子酚酸到分子量大于30,000Da的高度聚合化合物均可歸于酚類物質(zhì)[1]，按化學結構的差異可分為酚酸類、黃酮類、二苯乙烯、香豆素、單寧等5大類�？Х人崾欠铀犷惢衔锏拇硇詥误w，在諸多蔬菜和水果中均有分布。另一種常見的酚酸是阿魏酸，可經(jīng)酯化反應結合在阿拉伯木聚糖和半纖維素的側鏈殘基上，主要存在于谷物外殼部分。黃酮類化合物的結構特征是2個芳香環(huán)和3個碳原子結合在一起形成的含氧雜環(huán)，根據(jù)雜環(huán)的類型可分為6類：黃酮、黃烷酮、黃烷醇、黃酮醇、花青素和異黃酮。最常見的黃酮類是槲皮素，是廣泛存在于洋蔥、茶葉、水果的黃酮醇類；兒茶素是常見于于茶和水果中的黃烷醇類；橙色素，廣泛分布于于柑橘類水果中，屬于黃烷酮類；矢車菊素是一種常見的花色素，賦予黑醋栗，覆盆子，草莓等水果鮮艷的顏色，不同水果中含量各不相同。豆類及豆制品中存在大量的異黃酮類，如黃豆苷元、染料木黃酮，因其與雌激素有相似結構，又被稱為植物雌激素[2]。

可為高效開發(fā)降血糖產(chǎn)品提供理論依據(jù)，有助于桑葉資源的精深利用。1.5 主要研究內(nèi)容研究內(nèi)容主要分四個部分，研究技術路線見圖1-2。（1）不同桑品種的桑葉總多酚及單體酚類物質(zhì)分析。通過高效液相色譜法外標法，系統(tǒng)分析測定大 10、抗青 10 號、阿 2、69、農(nóng)桑 14、粵桑 11 號 6 個代表性品種桑葉的多酚單體組成和含量差異，并且篩選出合適的品種進行后續(xù)實驗。（2）桑葉多酚富集工藝優(yōu)化。篩選適合桑葉多酚分離的大孔樹脂類型，優(yōu)化大孔樹脂吸附和解吸最佳工藝參數(shù)，分析純化前后桑葉多酚單體組成變化。（3）桑葉多酚對二糖酶的抑制作用研究。分別探討桑葉多酚提取物對小鼠腸道來源的蔗糖酶和麥芽糖酶、Caco-2 細胞上的蔗糖酶和麥芽糖酶的抑制作用。（4）桑葉多酚對葡萄糖轉運的影響。通過 Caco-2 單層細胞腸道吸收模型研究桑葉多酚提取物對 Caco-2 細胞上葡萄糖轉運的影響，推測其主要影響的葡萄糖轉運蛋白。明確了桑葉多酚通過影響 SGLT1、GLUT2、PKA、PKC、PLC 等關鍵細胞因子抑制葡萄糖吸收的調(diào)控通路，初步探明桑葉多酚在二糖消化過程中的分子機制。圖 1-2 主要研究路線Fig 1-2 Main research route

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本文編號：2729972