【摘要】：第一部分當(dāng)歸六黃湯抗肝纖維化機(jī)制的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究及實驗驗證背景肝纖維化是多種慢性肝病共有的病理變化過程,其本質(zhì)是多種致病因素引起的細(xì)胞外基質(zhì)大量沉積和膠原纖維增生。若不及時治療,可導(dǎo)致終末期肝病、肝硬化、肝功能衰竭甚至肝癌。然而,目前除了肝移植外,許多療法仍處于臨床前研究階段,缺少行之有效的可以徹底治愈該疾病的方法。因此,我們急需尋找有效的抗肝纖維化治療方法。傳統(tǒng)中藥是補充和替代醫(yī)學(xué)體系的重要組成部分,在中國用于臨床治療疾病已有多年的歷史。當(dāng)歸六黃湯(DGLHD)是由當(dāng)歸、生地黃、熟地黃、黃芩、黃連、黃柏、黃芪組成的一種經(jīng)典中藥復(fù)方,在臨床上可用于治療糖尿病、感染、心肌炎等。大量研究表明DGLHD的組成成分如黃芪、當(dāng)歸、黃連具有抗炎、抗纖維化和保肝作用。然而,DGLHD是否具有抗肝纖維作用、潛在的作用機(jī)制是什么,發(fā)揮藥效的活性成分和作用靶點有哪些,仍不清楚。目的采用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)的方法探究DGLHD所含的活性成分及其抗肝纖維化的作用靶點,然后采用動物和細(xì)胞實驗驗證預(yù)測結(jié)果,以闡明DGLHD抗肝纖維化的作用機(jī)制,為肝纖維化的治療提供新方法。方法1)DGLHD活性成分和靶點的預(yù)測從TCMSP、TCM Database@Taiwan、PubMed等數(shù)據(jù)庫及相關(guān)文獻(xiàn)資料中收集DGLHD及其所含七味單藥的化學(xué)成分和靶點,并分析各味單藥所含成分的物理化學(xué)性質(zhì)異同點。挑選OB≥30%和/或DL≥0.1的化合物作為潛在活性成分,其對應(yīng)的靶點作為發(fā)揮藥效的潛在靶基因或蛋白。2)網(wǎng)絡(luò)分析從OMIM、Genecards、KEGG等數(shù)據(jù)庫中收集肝纖維化疾病相關(guān)的靶點。然后對DGLHD中度值大于3的作用靶點進(jìn)行GO功能和通路富集分析,探究DGLHD與肝纖維化之間的關(guān)系,并使用Cytoscape 2.8.3軟件對DGLHD的活性成分、作用靶點及肝纖維化有關(guān)靶點進(jìn)行網(wǎng)絡(luò)可視化分析。3)實驗驗證C57BL/6J小鼠隨機(jī)分為3組:空白組、模型組、DGLHD(5.0g/kg)組,腹腔注射4%(v/v)的四氯化碳油溶液誘導(dǎo)小鼠肝纖維化模型,同時給予DGLHD治療。6周后測定各組小鼠肝重指數(shù)及ALT、AST的活性,HE和Masson染色觀察肝臟病理形態(tài)學(xué)變化,CBA和qRT-PCR檢測小鼠血清和肝臟中TNF-α、IL-1β、TGF-β1和IFN-γ的表達(dá),Western blot和qRT-PCR方法檢測肝臟和活化HSC-T6細(xì)胞中TGF-β1、α-SMA、PPAR-γ、NF-κB的蛋白和基因表達(dá)水平,MTT法檢測HSC-T6細(xì)胞增殖。結(jié)果中藥復(fù)方DGLHD含有545個化學(xué)成分,其中75個化合物滿足OB≥30%和/或DL≥0.1,并將其作為DGLHD的潛在活性成分。我們收集了75個活性化合物對應(yīng)的286個活性靶點,其中有71個靶點的度值大于3。作用靶點的功能富集分析數(shù)據(jù)顯示這些靶基因不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo),還可以影響炎癥反應(yīng)及PPAR和NF-κB的活性。通路富集分析結(jié)果表明DGLHD的活性靶基因主要富集于MAPK、NF-κB、PI3K/Akt、NAFLD和肝炎相關(guān)通路。DGLHD活性成分對應(yīng)的71個靶點,其中有51個是肝纖維化的直接靶點,如PTGS2、NF-κBp65、PPAR-γ、PI3K、AKT1、TGF-β1。而且,DGLHD中的多種化學(xué)成分均可調(diào)節(jié)上述靶點的活性,如小檗堿、黃芩素、阿魏酸、黃連堿、黃芩苷、梓醇。因此,DGLHD中的某些化學(xué)成分可能通過這些靶點對肝纖維化進(jìn)行干預(yù)治療。實驗驗證結(jié)果表明DGLHD可明顯減輕肝纖維化小鼠肝臟損傷和纖維化程度,降低ALT和AST的活性,減少細(xì)胞外基質(zhì)合成和沉積,減弱炎性細(xì)胞因子表達(dá),降低NF-κBp65和TGF-β1的活性,增強PPAR-γ基因和蛋白表達(dá)水平,發(fā)揮明顯的肝保護(hù)和抗肝纖維化作用。結(jié)論DGLHD通過多成分、多靶點、多途徑減弱炎癥信號、抑制HSC細(xì)胞活化及細(xì)胞外基質(zhì)聚集,阻止小鼠肝纖維化的發(fā)生與發(fā)展。第二部分當(dāng)歸六黃湯對肥胖相關(guān)胰島素抵抗和脂肪肝的作用及機(jī)制研究背景肥胖是一種與多種疾病發(fā)生發(fā)展相關(guān)的病理狀態(tài),并常常伴隨著炎癥細(xì)胞浸潤、糖脂代謝異常、胰島素敏感性降低。研究表明受損的胰島素信號轉(zhuǎn)導(dǎo)與炎癥反應(yīng)、異常的糖脂代謝協(xié)同促進(jìn)肝臟脂質(zhì)生物合成和脂肪變性,從而導(dǎo)致胰島素抵抗和脂肪肝的發(fā)生發(fā)展。而且,炎癥、代謝異常、胰島素抵抗和脂肪肝是肥胖個體中常見的相互影響的病理狀態(tài)。多種免疫細(xì)胞均參與了肥胖相關(guān)炎癥和代謝性疾病的發(fā)展,如DCs、Tregs、CD8+T細(xì)胞、B細(xì)胞。肥胖小鼠脂肪組織中Tregs數(shù)量的增加可以改善其胰島素敏感性和脂肪聚集程度。清除CD11c-DTR轉(zhuǎn)基因小鼠體內(nèi)的DCs可改善肥胖相關(guān)炎癥、胰島素抵抗及肝臟脂肪變性,并減少脂質(zhì)合成代謝相關(guān)基因的表達(dá)。由此可知,Tregs和DCs在炎癥、胰島素抵抗和脂肪肝的發(fā)展中起到了關(guān)鍵作用。隨著現(xiàn)代生活方式的改變,肥胖相關(guān)疾病的發(fā)生率和死亡率逐年升高。然而,目前的治療藥物由于作用靶點單一、失效率高、副作用大等特點,并不能有效的阻止胰島素抵抗和肝臟脂肪變性的發(fā)展。現(xiàn)代藥理學(xué)研究顯示當(dāng)歸六黃湯具有降血糖、胰島素增敏、抗炎、抗感染等作用。但DGLHD是否可以有效地抑制肥胖相關(guān)胰島素抵抗和脂肪肝的發(fā)生發(fā)展及發(fā)揮這些藥效的機(jī)制尚未闡明。目的采用瘦素基因缺陷的ob/ob小鼠模型,研究DGLHD抗胰島素抵抗和脂肪肝的過程中免疫細(xì)胞、代謝產(chǎn)物和糖脂代謝的變化及機(jī)制,為DGLHD的臨床應(yīng)用提供依據(jù),為中醫(yī)藥的研究開發(fā)提供新思路。方法Ob/ob小鼠隨機(jī)分為4組:模型對照組、DGLHD(1.5g/kg)組、DGLHD(3.0g/kg)組、DGLHD(6.0g/kg)組,每組小鼠給予等體積的三蒸水或DGLHD。8周后測定各組小鼠肝重指數(shù)、內(nèi)臟脂肪指數(shù),OGTT和ITT實驗分別測定小鼠的葡萄糖耐受性及胰島素敏感性,HE和油紅O染色觀察脂肪組織或肝臟病理形態(tài)學(xué)變化,免疫組化檢測胰腺胰島分泌胰島素的水平,微板法檢測血清及肝臟中TC、TG、FFA的含量,ELISA方法測定小鼠血清細(xì)胞因子、胰島素及脂聯(lián)素的含量,葡萄糖氧化酶法檢測細(xì)胞消耗的葡萄糖量,流式細(xì)胞術(shù)檢測免疫細(xì)胞的比例、表面標(biāo)記及功能,MTT法檢測混合淋巴細(xì)胞反應(yīng)及細(xì)胞增殖水平,靶向代謝組學(xué)檢測肝臟及脂肪組織中代謝產(chǎn)物的含量,Western blot和q RT-PCR法檢測有關(guān)蛋白及基因的表達(dá)水平。體外實驗研究DGLHD對DCs、T細(xì)胞和胰島素抵抗3T3-L1細(xì)胞的作用,按照上述有關(guān)方法檢測細(xì)胞因子、表面標(biāo)記、葡萄糖消耗、蛋白及基因等指標(biāo)。結(jié)果與模型組小鼠相比,給予ob/ob小鼠DGLHD后,小鼠肝臟組織的脂肪聚集變性減弱,血清和肝臟中FFA、TC、TG表達(dá)水平降低,肝臟和內(nèi)臟脂肪組織的重量減輕,肝臟和內(nèi)臟脂肪組織的形態(tài)結(jié)構(gòu)較為規(guī)則完整,且劑量為6.0g/kg時的效果最為明顯。此外,DGLHD可明顯改善ob/ob小鼠的口服葡萄糖耐受性及腹腔胰島素耐性,減少胰島素分泌,并增加脂聯(lián)素的表達(dá)水平。DGLHD還可明顯降低小鼠血清、脾臟、肝臟及內(nèi)臟脂肪組織中促炎細(xì)胞因子TNF-α、IFN-γ的表達(dá)水平,并減弱T淋巴細(xì)胞的增殖。我們通過實驗進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)DGLHD主要通過影響氨基酸和嘌呤代謝減少ob/ob小鼠脂肪和肝臟組織中異亮氨酸、腺苷和膽固醇含量,增加谷氨酰胺的表達(dá)水平。DGLHD促進(jìn)ob/ob小鼠脾臟、淋巴結(jié)、肝臟及脂肪組織中Tregs分化及Foxp3基因表達(dá),升高T細(xì)胞表面負(fù)性調(diào)節(jié)分子PD-1的水平。清除ob/ob小鼠體內(nèi)的Tregs后,小鼠胰島素抵抗、脂肪肝和炎癥狀態(tài)加重。有趣的是,給予DGLHD可逆轉(zhuǎn)Tregs清除后的相關(guān)改變。體外實驗顯示DGLHD可抑制T細(xì)胞增殖,促進(jìn)T細(xì)胞分化為Tregs,并促進(jìn)Th1型細(xì)胞因子向Th2型細(xì)胞因子的轉(zhuǎn)化。DGLHD降低DCs表面MHC-II和CD86的表達(dá)水平,增強負(fù)性共刺激分子PD-L1的表達(dá),減弱DCs刺激T細(xì)胞增殖的能力,上調(diào)IDO和ILT-3的基因水平,抑制DCs分泌IL-12p70細(xì)胞因子。此外,DGLHD還可抑制Tregs清除小鼠體內(nèi)DCs的成熟。體外實驗結(jié)果也表明DGLHD抑制DCs成熟,減弱抗原呈遞能力及IL-12p70的分泌。代謝相關(guān)指標(biāo)表明DGLHD可減少DCs和T細(xì)胞的葡萄糖攝取,抑制PI3K/Akt通路的活化,增強PPAR-γ蛋白和基因的表達(dá)水平,促進(jìn)體內(nèi)和體外耐受性DCs和Tregs的形成。同時,DGLHD還可抑制肝臟和內(nèi)脂肪組織中FAS、ACC-1、CD36、SREBP-1c基因的表達(dá),激活PI3K/Akt信號通路,改善ob/ob小鼠肝臟和脂肪組織的糖脂代謝。在胰島素抵抗的3T3-L1脂肪細(xì)胞中,DGLHD也可增加其葡萄糖消耗及脂聯(lián)素水平,激活PI3K/Akt通路,減少脂質(zhì)生物合成。結(jié)論DGLHD通過調(diào)節(jié)PI3K/Akt信號通路和PPAR-γ分子改善ob/ob小鼠的免疫和代謝穩(wěn)態(tài),發(fā)揮有效的抗炎、抗胰島素抵抗和抗脂肪肝作用。
【學(xué)位授予單位】：華中科技大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5
【圖文】：

圖 1 DGLHD 中各味單藥所含成分的物理化學(xué)性質(zhì)正態(tài)分布圖。DGLHD 含有 7種草藥，即當(dāng)歸(AG)、黃芪(AM)、黃柏(GC)、黃連(CC)、黃芩(SB)、生地黃(RR)、熟地黃(RRP)。化合物的分子特性主要包括分子量(MW)、口服生物利用度(OB)、成藥性(DL)、氫鍵供體數(shù)(HDon)、氫鍵受體數(shù)(HAcc)和醇-水分配系數(shù) logP

靶點 AP-1 HTR2C ADRA2C TNF-α CYP101 TG度值 5 4 4 4 4 靶點 CYP1A2 ADH1C AKT1 P53 PDE10A度值 4 4 4 4 43.3 DGLHD 潛在靶點的通路和功能富集分析我們對 71 個度值大于 3 的靶基因進(jìn)行了通路和 GO 功能富集分析，其調(diào)節(jié)的相關(guān)通路和功能。結(jié)果顯示，DGLHD 中的活性靶標(biāo)明顯富集于 MNF-κB、PI3K/Akt、NAFLD 和肝炎相關(guān)通路（圖 2A）。此外，功能分析數(shù)這些靶基因不僅可以調(diào)節(jié)細(xì)胞的生長、增殖、凋亡和信號轉(zhuǎn)導(dǎo)，還可以影反應(yīng)及 Akt、PPAR 和 NF-κB 的活性（圖 2B）。研究報道 PI3K/Akt、PPANF-κBp65 與肝纖維發(fā)展進(jìn)程中的炎癥反應(yīng)、膠原沉積、ECM 聚集等密切因此，根據(jù)以上理論分析數(shù)據(jù)及已有研究報道，我們推測 DGLDH 可能通PI3K/Akt、PPAR-γ 和 NF-κBp65 發(fā)揮抗肝纖維化作用。

【參考文獻(xiàn)】

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1 張彥瓊;李梢;;網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)與中醫(yī)藥現(xiàn)代研究的若干進(jìn)展[J];中國藥理學(xué)與毒理學(xué)雜志;2015年06期

2 鄧曉威;謝寧;;黃連素治療2型糖尿病研究進(jìn)展[J];中國中藥雜志;2014年08期

3 徐賢綢;林勝璋;;大黃素防治肝臟疾病的實驗研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2008年01期

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1 計雅純;中藥復(fù)方當(dāng)歸六黃湯質(zhì)量控制研究和XEDJ藥效學(xué)研究[D];華中科技大學(xué);2016年

本文編號：2729613