【摘要】：背景:膀耽癌是泌尿外科的常見惡性腫瘤之一,發(fā)病率為十大惡性腫瘤其中之一,膀胱癌在中國的發(fā)病率排在尿路惡性腫瘤的第一位。膀胱癌分為非肌肉浸潤性膀胱癌(NMIBC)和肌層浸潤性膀胱癌(MIBC),約75%至85%的新發(fā)現(xiàn)的膀胱癌是非肌肉浸潤性膀胱癌。經(jīng)尿道切除膀胱(TURBT)是NMIBC的主要診斷和治療方式,同時可獲得準(zhǔn)確的病理分期和分級。雖然TURBT可以有效去除腫瘤組織,但膀胱癌仍然存在高復(fù)發(fā)率。只有TURBT不通過膀胱灌洗補(bǔ)充治療膀胱癌,約45%的患者在1年內(nèi)復(fù)發(fā)。手術(shù)結(jié)合膀胱灌注治療可有效殺死殘余腫瘤,降低膀胱癌復(fù)發(fā)率。大多數(shù)膀胱內(nèi)灌注藥物如卡介苗(BCG),表柔比星,吡柔比星等用于術(shù)后預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)。這些藥物通常昂貴并且可引起嚴(yán)重的并發(fā)癥,例如尿頻,尿急,排尿困難等,血尿和免疫抑制等。因此,有必要找到一種有效但副作用較小的藥物來殺死膀胱腫瘤細(xì)胞。薯蕷皂苷元,通常稱為皂苷,是天然合成甾族皂苷,具有C27 H4203結(jié)構(gòu)式,分子量為414.63的甾醇糖苷配基(圖1 A),其廣泛存在于豆科植物和山藥科植物中。薯蕷皂苷元的主要來源是葫蘆巴的種子,也可以通過水楊酸,發(fā)酵,萃取等方法從盾葉薯蕷、穿龍薯蕷、黃山藥、紫黃姜等植物的塊莖中提取獲得。作為用于合成類固醇激素和留體避孕藥的重要原料,薯蕷皂苷配基通常用于生產(chǎn)藥物,例如孕烯醇酮,孕酮和可的松。在過去幾十年中,關(guān)于薯蕷皂苷元的研究越來越受到人們的重視。薯蕷皂苷元在多種腫瘤有明顯的抑制作用,然而其對膀胱腫瘤的抑制作用及機(jī)理仍不明確,本研究即從該角度出發(fā),探究薯蕷皂苷元對膀胱腫瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。目的:眾多的研究結(jié)果表明,薯蕷皂苷元可以在多種癌細(xì)胞中產(chǎn)生作用,包括乳腺癌細(xì)胞、結(jié)腸癌細(xì)胞、前列腺癌細(xì)胞、肺癌細(xì)胞、胃癌細(xì)胞、成骨肉瘤細(xì)胞等均有細(xì)胞毒性,其主要作用機(jī)制表現(xiàn)為:抑制腫瘤細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、阻斷細(xì)胞周期和抗腫瘤轉(zhuǎn)移等多種方式發(fā)揮抗腫瘤作用。然而其對膀胱腫瘤的抑制作用及機(jī)理目前尚不明確,本研究的目的旨在探究薯蕷皂苷元對膀胱腫瘤細(xì)胞的抑制作用及機(jī)制。具體如下:(1)在細(xì)胞層面探究薯蕷皂苷元對膀胱癌細(xì)胞(T24和5637)生長的抑制作用,明確量效關(guān)系。(2)明確薯蕷皂苷元對膀胱腫瘤細(xì)胞周期及凋亡的影響,并進(jìn)一步驗(yàn)證凋亡及周期相關(guān)基因及蛋白變化。(3)明確薯蕷皂苷元對膀骯腫瘤細(xì)胞遷移誘導(dǎo)的影響,并確定相關(guān)蛋白的表達(dá)狀況。(4)為臨床應(yīng)用薯蕷皂苷元治療膀胱腫瘤提供科學(xué)的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。方法:(1)應(yīng)用MTT法測定不同濃度(0,10,20,30,40,50,60微克/ml)的薯蕷皂苷元作用不同時間(24h,48h,72h)對膀胱腫瘤細(xì)胞系(T24及5637)的生長抑制作用;(2)流式細(xì)胞儀(FCM)采用PI染色檢測不同濃度的薯蕷皂苷元對膀胱腫瘤細(xì)胞株細(xì)胞周期分布的影響。(3)采用Annexin V/PI凋亡試劑盒通過FCM分析檢測薯蕷皂苷元對膀胱腫瘤細(xì)胞凋亡的影響情況,觀察是否具有濃度依賴性。(4)應(yīng)用Transwell及細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)檢測薯蕷皂苷元作用膀胱腫瘤細(xì)胞后細(xì)胞遷移能力的變化(5)應(yīng)用PCR和Westen-blot分析藥物對細(xì)胞基因組及蛋白組的影響。結(jié)果:(1)MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,不同濃度薯蕷皂苷元(0,10,20,30,40,50及60微克/mL)處理膀胱癌細(xì)胞株5637和T24細(xì)胞,薯蕷皂苷元能夠抑制膀癌T24和5637細(xì)胞的增殖,并呈劑量和時間依賴性。(2)利用PCR在不同濃度及不同時間薯蕷皂苷元抑制T24及5637細(xì)胞中來檢測Bcl,Bax,Caspase-3等的表達(dá)。結(jié)果顯示,隨著薯蕷皂苷元濃度的增加及處理時間的延長,在T24及5637細(xì)胞中相關(guān)mRNA的表達(dá)有明顯的變化趨勢。這些結(jié)果表明,薯蕷皂苷元對相關(guān)基因的表達(dá)具有濃度依賴性和時間依賴性。(3)通過流式細(xì)胞儀技術(shù),薯蕷皂苷元處理的膀胱腫瘤細(xì)胞停滯分裂在GO/G1期,與未處理的細(xì)胞相比,隨著薯蕷皂苷元濃度的增加,停滯在GO/G1期的腫瘤細(xì)胞逐漸增多,并且具有濃度依賴性。(4)我們通過對膀胱癌細(xì)胞進(jìn)行annexin V和PI雙染,流式結(jié)果顯示薯蕷皂苷元可以誘導(dǎo)膀胱癌細(xì)胞株T24及5637細(xì)胞的早期和晚期的凋亡,并且有濃度依賴性。(5)Transwell實(shí)驗(yàn)及劃痕實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明,薯蕷皂苷元可以降低膀胱腫瘤細(xì)胞T24及5637的遷移能力,與對照組相比較,穿過transwell小室的細(xì)胞數(shù)目及細(xì)胞遷移率明顯減少。(6)Westernblot結(jié)果顯示,通過逐漸增加的濃度及時間處理,在T24細(xì)胞中Bcl-2,Caspase-3,Vimentin等蛋白的表達(dá)有明顯的逐漸減低趨勢,Bax等蛋白的表達(dá)逐漸增加,并具有時間和濃度依賴性。結(jié)論:以上結(jié)果表明薯蕷皂苷元能夠通過調(diào)節(jié)凋亡相關(guān)基因Bcl-2,周期相關(guān)基因CDK2/4/6,CyclinD1,遷移相關(guān)基因N-cadherin,Vimentin等的表達(dá),阻滯GO/G I細(xì)胞周期,誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡,阻止細(xì)胞遷移,從而抑制膀胱癌T24及5637細(xì)胞的增殖和侵襲效應(yīng),同時更有效的殺傷膀胱腫瘤細(xì)胞。因此,通過薯蕷皂苷元干預(yù)的腫瘤細(xì)胞其生長活性明顯受抑制,薯蕷皂苷元將來可作為一種新的膀胱癌的術(shù)后用藥的可能。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285
【圖文】：

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本文編號：2729227