【摘要】：目的:作為一種慢性心血管炎癥損傷性疾病,動脈粥樣硬化(atherosclerosis,AS)已成為謀害現(xiàn)代人類健康的主角。研究發(fā)現(xiàn)AS的形成和發(fā)展主要誘因是由人體內(nèi)某些微生物感染,造成相關(guān)炎性因子分泌增加及急性時相蛋白表達(dá)上升,內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)結(jié)構(gòu)和功能異常而導(dǎo)致的。細(xì)菌脂多糖(lipopolysaccheride,LPS)作為AS感染過程中的炎癥啟動因子,能依附于血管內(nèi)皮細(xì)胞,隨之,內(nèi)皮細(xì)胞(VECs)與平滑肌細(xì)胞(SMCs)彼此干預(yù)從而引起機體炎性綜合癥。甲基蓮心堿(Neferine,Nef)有調(diào)節(jié)心律,降低血脂,消炎癥,清除氧自由基等抗心血管疾病的藥理作用。因此,本實驗旨在從細(xì)胞水平闡述甲基蓮心堿治療動脈粥樣硬化過程中發(fā)揮的作用。圍繞共培養(yǎng)環(huán)境下,SMCs會調(diào)控HUVECs的增殖與分泌;LPS刺激人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)炎性損傷的分子機制進(jìn)行觀察;研究Nef對炎性損傷后HUVECs中NF-κB信號通路中蛋白表達(dá)影響,探討Nef防治AS的新靶點及依據(jù)。方法:對人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞(HUVECs)進(jìn)行培養(yǎng),用LPS刺激HUVECs,根據(jù)損傷程度篩選出LPS誘導(dǎo)水平;為了模擬體內(nèi)環(huán)境,我們建立間接接觸HUVECs-SMCs的共培養(yǎng)系統(tǒng);通過CCK8測定比較不同濃度的甲基蓮心堿對損傷HUVECs細(xì)胞的凋亡率的差異;Griess Reagent法用于檢測細(xì)胞內(nèi)一氧化氮(NO)的含量;比色法測定細(xì)胞內(nèi)一氧化氮合酶(NOS)分型的活力;流式細(xì)胞技術(shù)檢測甲基蓮心堿對誘導(dǎo)損傷后HUVECs細(xì)胞損傷情況;采用免疫印跡法(Western blot)檢測HUVECs內(nèi)NF-κB信號通路相關(guān)蛋白表達(dá)的變化;ELISA法檢測黏附因子TNF-α和細(xì)胞間黏附因子-1(ICAM-1)分泌水平,采用實時熒光定量PCR方法檢測TNF-α和ICAM-1的mRNA相對表達(dá)。結(jié)果:LPS刺激HUVECs 24h后,CCK8檢測到LPS的濃度為100ug/ml時細(xì)胞損傷適中,確定為誘導(dǎo)濃度(P0.05);CCK8檢測和流式結(jié)果顯示Nef能抑制LPS刺激損傷HUVECs的細(xì)胞凋亡,并呈一定的濃度依賴性(P0.05);Nef還能顯著性逆轉(zhuǎn)共培養(yǎng)前提下LPS誘導(dǎo)的人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO含量的增加和總NOS(tNOS)及iNOS的活性的升高(P0.05);Western blot結(jié)果顯示,在Nef干預(yù)LPS刺激損傷的VECs-SMCs共培養(yǎng)體系后,降低了 NF-κB通路中p65的表達(dá),而提高了 IκB-α表達(dá),并且差異具有統(tǒng)計學(xué)意義;ELISA法和RT-PCR結(jié)果表明,Nef下調(diào)了炎性感染中TNF-α和ICAM-1相關(guān)因子的分泌和表達(dá),且呈一定的濃度依賴性,P0.05。結(jié)論:甲基蓮心堿能夠逆轉(zhuǎn)LPS誘導(dǎo)的人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞的損傷,調(diào)節(jié)共培養(yǎng)條件下人臍血管內(nèi)皮細(xì)胞中NO的釋放和NOS的活力,并且通過抑制血管內(nèi)皮細(xì)胞NF-κB信號通路,下調(diào)TNF-α和ICAM-1等炎性因子的表達(dá),抑制了炎癥的發(fā)展,達(dá)到抗動脈粥樣硬化的目的。
【學(xué)位授予單位】：武漢大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5
【圖文】：

邐甲基蓮必堿對ＬＰＳ刺激的共培養(yǎng)條件下血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及機理研巧；邐逡逑高為（１２．６６±０．４０）邋％，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，Ｐ＜０．０５，說明甲基蓮也堿抑制細(xì)逡逑胞損傷在一定濃度范圍下呈濃度依賴性，過高濃度的甲基蓮?fù)汀A反而對ＨＵＶＥＣｓ逡逑細(xì)胞有損傷。逡逑圖３．２流式細(xì)胞儀檢測各組ＨＵＶＥＣｓ細(xì)胞的調(diào)亡情況逡逑Ｆｉｇｕｒｅ邋３．２邋Ｔｈｅ邋ｃｅｌｌ邋ａｐｏｐｔｏｓｉｓ邋ｏｆ邋ｅａｃｈ邋ｇｒｏｕｐ邋ｉｎ邋ＨＵＶＥＣｓ邋ｗｅｒｅ邋ｄｅｔｅｃｔｅｄ邋ｂｙ邋ｆｌｏｗ邋ｃｙｔｏｍｅｔｒｙ逡逑邐

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本文編號：2728095