【摘要】：目的1.通過EP管結(jié)晶紫染色法、SEM法、TEM法等不同實驗方法來鑒定銅綠假單胞菌生物被膜的形成及觀察不同濃度黃芩苷對銅綠假單胞菌BF的干預(yù)作用。2.用熒光定量PCR法觀察不同濃度黃芩苷對las R、rhl R和pvd Q基因作用后m RNA表達(dá)量是否存在顯著性差異,分析黃芩苷對銅綠假單胞菌BF的干預(yù)作用與QS系統(tǒng)的相關(guān)性,在基因水平探討黃芩苷干預(yù)銅綠假單胞菌BF的作用機(jī)制。方法1.實驗以銅綠假單胞菌標(biāo)準(zhǔn)菌株ATCC27853為研究對象,采用EP管結(jié)晶紫染色法鑒定銅綠假單胞菌生物被膜的形成,并分別觀察銅綠假單胞菌在培養(yǎng)72h、96h、120h、144h和168h(即第7天)后生物被膜形成狀況。2.采用掃描電鏡(SEM法)分別觀察在黃芩苷15 mg/ml、7.5 mg/ml、3.75mg/ml濃度作用下對培養(yǎng)至第7天時銅綠假單胞菌生物被膜形態(tài)的影響。3.采用透射電鏡(TEM法)分別觀察黃芩苷在15 mg/ml、7.5 mg/ml、3.75mg/ml濃度下對培養(yǎng)至第7天時銅綠假單胞菌生成生物被膜形態(tài)的影響。4.采用96孔板定量測定法檢測銅綠假單胞菌在黃芩苷15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156mg/ml 8個不同濃度作用下144h內(nèi)形成生物被膜的厚度。5.采用實時熒光定量PCR技術(shù)觀察不同濃度黃芩苷對群體感應(yīng)系統(tǒng)中與生物被膜生成密切相關(guān)的基因Las R、Rhl R及Pvd Q作用后m RNA表達(dá)水平的影響,并分析其相關(guān)性。結(jié)果1.EP管結(jié)晶紫染色法顯示銅綠假單胞菌在培養(yǎng)到第5-7天左右EP管壁呈現(xiàn)紫色染最明顯,提示銅綠假單胞菌生物被膜生成陽性。2.掃描電鏡(SEM法)實驗結(jié)果顯示,在相同的培養(yǎng)時間下,空白對照組銅綠假單胞菌在培養(yǎng)第7天后在30000放大倍數(shù)下可觀察到分化成熟且致密的生物被膜結(jié)構(gòu)不均勻地黏附于錫紙表面,銅綠假單胞菌被濃厚的黏液樣物質(zhì)包裹在其中,僅有少量細(xì)菌菌體不完全游離于外;與空白對照組相比黃芩苷低劑量組(3.75mg/ml)銅綠假單胞菌在培養(yǎng)第7天后可見少量黏液狀生物被膜存在,細(xì)菌附著于錫紙載體上呈現(xiàn)聚集和增殖狀態(tài);隨著黃芩苷的濃度逐漸增加到高劑量(15 mg/ml)時,細(xì)菌胞間逐漸呈現(xiàn)無黏液狀物質(zhì)包裹,菌體呈長桿狀分散分布,背景清晰,未見生物被膜存在,與空白對照組比較有明顯性差異。3.透射電鏡(TEM法)實驗結(jié)果顯示,在相同培養(yǎng)7天的時間下,空白對照組在負(fù)染色條件下背景清晰度很好,細(xì)菌形態(tài)立體飽滿,大小不一,呈重疊樣聚集生長,各菌體被不規(guī)則黏液樣物質(zhì)包裹;與空白對照組相比黃芩苷低劑量組(3.75mg/ml)濃度作用下細(xì)菌形態(tài)不均且分散不均勻,呈現(xiàn)菌體之間有纖維狀物質(zhì)連接的聚集生長狀態(tài),菌體周圍可見碎片狀、塔狀或蘑菇狀不規(guī)則成熟生物被膜結(jié)構(gòu)。隨著黃芩苷的濃度逐漸增加到高劑量時,銅綠假單胞菌呈分散生長,菌體邊緣清晰,可見細(xì)菌鞭毛,未見明顯生物被膜結(jié)構(gòu),與空白對照組比較有明顯性差異。4.96孔板定量檢測法實驗結(jié)果:黃芩苷在15、10、5、2.5、1.25、0.625、0.312、0.156mg/ml 8個劑量下,144h內(nèi)均可影響銅綠假單胞菌生物被膜的生長;黃芩苷在0.625 mg/ml以上劑量時,在24、48、72、96、120、144 h各時間段生物被膜的厚度有顯著性變薄,和空白對照組比較發(fā)現(xiàn)在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);但是在0.312 mg/ml和0.156mg/ml劑量時的黃芩苷作用下銅綠假單胞菌的生物被膜在后期和空白對照組差別很小,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。5.實時熒光定量PCR實驗結(jié)果顯示,和空白對照組比較,黃芩苷在高、中和低劑量下均可降低las R、和pvd Q基因表達(dá),在統(tǒng)計學(xué)上存在顯著性差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);黃芩苷在高劑量和中劑量時rhl R基因的m RNA表達(dá)量明顯低于空白對照組,具有顯著性差異,有統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05);在黃芩苷低劑量時rhl R基因的m RNA表達(dá)量和空白對照組比較降低不明顯,無統(tǒng)計學(xué)意義(P0.05)。結(jié)論1.黃芩苷可以在銅綠假單胞菌生物被膜生成和成熟的過程中起明顯干預(yù)作用,能分解大片狀黏稠的生物被膜,降低生物被膜的厚度。2.不同濃度的黃芩苷能降低銅綠假單胞菌群體感應(yīng)系統(tǒng)中與生物被膜生成密切相關(guān)的las R、rhl R基因和pvd Q基因m RNA的表達(dá),提示這可能是黃芩苷干預(yù)銅綠假單胞菌生物被膜形成和成熟的作用機(jī)制。
【學(xué)位授予單位】：河南中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285
【圖文】：

結(jié)果結(jié)果果管結(jié)晶紫染色法實驗結(jié)果 EP 管壁呈現(xiàn)紫色染，則提示生物被膜形成陽性，經(jīng)過到第 5-7 天左右 EP 管壁呈現(xiàn)紫色染最明顯，顯示銅綠，見圖 1，符合實驗要求。

圖 2 黃芩苷高劑量組（15 mg/ml）生物被膜在培養(yǎng)第 7 天后 SEM 鏡下形態(tài)根據(jù)上圖掃描電鏡（SEM）下顯示，黃芩苷高劑量組（15 mg/ml）銅綠假單菌在培養(yǎng)第 7 天后未見生物被膜存在，細(xì)菌胞間無黏液狀物質(zhì)包裹，鏡下觀察體呈長桿狀分散分布，背景清晰，除極少量細(xì)菌有疊加外，大部分都分散附著錫紙載體上，類似浮游狀態(tài)，未見黏液狀生物被膜結(jié)構(gòu)。1.2.2 黃芩苷中劑量組（7.5 mg/ml）生物被膜在培養(yǎng)第 7 天后 SEM 鏡下的形態(tài)，圖 3。

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號：2727071