【摘要】：1目的蒼術(shù)為常用燥濕健脾藥,其不同的炮制飲片主治功效各有側(cè)重。生蒼術(shù)燥濕,祛風(fēng),散寒能力強(qiáng),主要用于濕阻中焦,風(fēng)濕痹痛,肌膚麻木,腳膝疼痛,風(fēng)寒感冒等;而焦蒼術(shù)健脾止瀉作用增強(qiáng),臨床主要用于治療脾虛、濕困脾胃而引起的腹瀉。本研究通過對(duì)蒼術(shù)炒焦前后非揮發(fā)性提取部位健脾止瀉藥效的研究,以藥效為向?qū)?尋找蒼術(shù)炒焦后藥效改變的變量成分,特別是增量成分,并探討焦蒼術(shù)健脾止瀉的藥理機(jī)制,初步闡釋焦蒼術(shù)的炮制原理及其長(zhǎng)于“健脾止瀉”的主要物質(zhì)基礎(chǔ)和作用機(jī)理。2方法與結(jié)果2.1蒼術(shù)炒焦前后各提取部位“健脾止瀉”藥效研究蒼術(shù)炒焦前后水提物部分依次用二氯甲烷、水飽和的正丁醇依次萃取,得到二氯甲烷部位、正丁醇部位和萃余水部位,制成各提取部位浸膏。選擇脾虛泄瀉模型,參苓白術(shù)丸為陽性藥;以腹瀉指數(shù)、小腸推進(jìn)率、胃殘留率、血漿MTL、血清GAS、VIP、TNF-α、IL-10和結(jié)腸AQP_3為考察指標(biāo),進(jìn)行生蒼術(shù)和焦蒼術(shù)各提取部位的藥效學(xué)研究。結(jié)果顯示,宏觀腹瀉指數(shù)方面,焦品組顯著低于相應(yīng)部位、相同劑量的生品組(P0.05),且焦品正丁醇部位高劑量組腹瀉指數(shù)降低至與陽性藥組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);在調(diào)節(jié)胃腸動(dòng)力(小腸推進(jìn)率、胃殘留率、血漿MTL、血清GAS、VIP)方面,正丁醇部位二氯甲烷部位水部位,且焦品正丁醇部位對(duì)胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)功能明顯優(yōu)于生品正丁醇部位(P0.05);在炎性因子調(diào)節(jié)方面,正丁醇部位藥效明顯優(yōu)于二氯甲烷部位和水部位,且焦品正丁醇部位對(duì)炎癥的作用強(qiáng)度明顯優(yōu)于相應(yīng)劑量生品正丁醇部位(P0.05);此外,在結(jié)腸AQP_3表達(dá)方面,焦蒼術(shù)正丁醇部位高、低劑量組顯著優(yōu)于其他給部位藥組,并與正常組和陽性組無顯著性差異(P0.05)。2.2各提取部位對(duì)中焦?jié)裥暗挠绊戇x擇濕阻中焦模型,香砂胃苓丸為陽性藥;以腎臟AQP_2、血漿ALD和電解質(zhì)水平為指標(biāo),考察生蒼術(shù)和焦蒼術(shù)各提取部位對(duì)模型動(dòng)物水鹽代謝的影響。結(jié)果,模型組大鼠AQP_2和ALD顯著升高(P0.01),表明水濕內(nèi)停;同時(shí)模型大鼠血漿K~+濃度較正常組顯著降低(P0.05),而Na~+和Cl~-濃度有所升高,但無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。經(jīng)給藥處理后,陽性藥組、生品正丁醇部位高劑量組大鼠腎臟AQP_2和血漿ALD顯著降低,且其血漿K~+水平升高至與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異外(P0.05);其他給藥組藥效不顯著。2.3蒼術(shù)炒焦前后非揮發(fā)性主要增量成分研究通過鏡像對(duì)比生蒼術(shù)和焦蒼術(shù)正丁醇提取部位的HPLC指紋圖譜,發(fā)現(xiàn)焦蒼術(shù)正丁醇部位指紋圖譜在3.4、4.5、9.0、15.4、23.6 min分別有5個(gè)峰面積顯著升高的對(duì)應(yīng)色譜峰,同時(shí)5.4、8.6 min產(chǎn)生2個(gè)面積較小的新色譜峰。結(jié)合蒼術(shù)文獻(xiàn)和課題組前期在麩炒蒼術(shù)藥效成分研究的積累,測(cè)定蒼術(shù)中主要藥效成分含量,結(jié)果焦蒼術(shù)中5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A和鞣質(zhì)的含量顯著高于生蒼術(shù),增量幅度依次為18倍以上、50%以上和125%以上;且焦蒼術(shù)吸附力明顯增強(qiáng),增幅達(dá)15%以上。2.4焦蒼術(shù)主要增量成分“健脾止瀉”藥效研究2.4.1對(duì)急性腹瀉小鼠腹瀉指數(shù)的影響模型組小鼠大黃灌胃1 h后陸續(xù)出現(xiàn)明顯的腹瀉癥狀,且腹瀉指數(shù)達(dá)到0.9以上,而正常組無稀便現(xiàn)象。與模型組相比,各給藥組小鼠首次稀便時(shí)間延遲,腹瀉指數(shù)不同程度降低;除5-羥甲基糠醛低劑量組外,各給藥組腹瀉指數(shù)均與模型組有顯著性差異(P0.05),其中5-羥甲基糠醛高劑量組,蒼術(shù)苷A高劑量組,鞣質(zhì)高、低劑量組和聯(lián)合給藥高、低劑量組有極顯著差異(P0.01)。2.4.2對(duì)胃腸動(dòng)力的影響采用大黃灌胃法造模,經(jīng)給藥、取樣,ELISA法等檢測(cè)。結(jié)果,模型大鼠小腸推進(jìn)率、血漿MTL和血清GAS極顯著降低(P0.01),而胃殘留率和血清VIP極顯著升高(P0.01)。給藥后,5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A、鞣質(zhì)和聯(lián)合給藥組均表現(xiàn)出增強(qiáng)胃腸動(dòng)力作用,其中5-羥甲基糠醛和蒼術(shù)苷A高劑量組,鞣質(zhì)和聯(lián)合低劑量組對(duì)胃腸動(dòng)力的調(diào)節(jié)作用較顯著,且顯示三者在促進(jìn)胃腸動(dòng)力方面存在一定協(xié)同作用;同時(shí),鞣質(zhì)高劑量組和聯(lián)合高劑量組對(duì)胃腸動(dòng)力調(diào)節(jié)作用反而減弱。2.4.3對(duì)消化道炎癥的影響ELISA檢測(cè)結(jié)果顯示,模型組大鼠血清TNF-α極顯著升高(P0.01),而IL-10水平極顯著降低(P0.01),并伴隨明顯的腹瀉癥狀,消化道炎癥明顯。各給藥組TNF-α水平較模型組極顯著降低(P0.01),IL-10水平顯著升高(P0.05);其中陽性藥組、5-羥甲基糠醛高劑量組和聯(lián)合高劑量組TNF-α水平與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05),且陽性藥組、鞣質(zhì)高劑量組和聯(lián)合高劑量組IL-10水平極顯著升高(P0.01)。同時(shí),結(jié)腸切片HE染色結(jié)果顯示,陽性藥組和5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A、鞣質(zhì)高劑量組以及聯(lián)合高劑量組炎癥恢復(fù)明顯,表現(xiàn)為藍(lán)紫色區(qū)域減少、固縮細(xì)胞聚集區(qū)密度顯著降低,柱狀和杯狀細(xì)胞分布較規(guī)整,絨毛形態(tài)清晰,斷裂減少。2.4.4對(duì)水鹽代謝的影響ELISA和生化檢測(cè)結(jié)果顯示,模型大鼠結(jié)腸AQP_3極顯著降低(P0.01),腎臟AQP_2顯著升高(P0.05),同時(shí)血漿ALD極顯著升高(P0.01),但血漿電解質(zhì)水平與正常組不存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。在對(duì)水通道蛋白調(diào)節(jié)方面,除5-羥甲基糠醛低劑量外,其他給藥組結(jié)腸AQP_3的表達(dá)水平均顯著高于模型組(P0.05);單獨(dú)給藥對(duì)腎臟AQP_2影響不顯著,只有聯(lián)合高劑量組腎臟AQP_2表達(dá)水平顯著降低,與正常組無差異(P0.05);而血漿ALD方面,也只有聯(lián)合高劑量組表現(xiàn)出顯著藥效。此結(jié)果提示,5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A和鞣質(zhì)在調(diào)控機(jī)體水液代謝方面可能具有一定協(xié)同作用,且存在劑量依賴關(guān)系。2.5焦蒼術(shù)“健脾止瀉”作用機(jī)理初步研究2.5.1對(duì)腸道菌群結(jié)構(gòu)的影響通過腸道菌群16SrDNA Amplicon測(cè)序,根據(jù)各細(xì)菌科屬的相對(duì)豐度值比較模型組和各給藥組腸道菌群結(jié)構(gòu)的變化。模型組大鼠腸道擬桿菌門(Bacteroidetes)豐度在腸道菌群中所占比例顯著降低,而厚壁菌門(Firmicutes)和變形菌門(Proteobacteria)豐度比例明顯增加,以擬桿菌屬(Bacteroides)和埃希菌屬(Escherchia/Shigella)為代表的條件致病菌豐度極顯著升高,而代表益生菌的乳桿菌屬(Lactobacillus)豐度極顯著降低。給藥后,5-羥甲基糠醛高劑量組、蒼術(shù)苷A高劑量組、鞣質(zhì)高劑量組和聯(lián)合高劑量組對(duì)擬桿菌屬和埃希菌屬均表現(xiàn)出明顯的抑制作用,其中5-羥甲基糠醛高劑量組和聯(lián)合高劑量組藥效最顯著,達(dá)到與正常組基本無差異;同時(shí),各給藥組乳桿菌屬豐度值較模型組更低。2.5.2對(duì)結(jié)腸5-HT及5-HTR表達(dá)水平的影響運(yùn)用ELISA和RT-PCR法檢測(cè)5-HT及及其受體5-HT4R、5-HT7R表達(dá)水平,結(jié)果顯示,模型大鼠結(jié)腸組織5-HT及5-HT4R、5-HT7R均顯著高表達(dá)(P0.01)。相較于模型組,各給藥組對(duì)結(jié)腸5-HT及5-HT4R、5-HT7R的過高表達(dá)均有顯著下調(diào)作用(P0.05);其中,5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A、鞣質(zhì)和聯(lián)合給藥高劑量組結(jié)腸5-HT含量恢復(fù)至與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);5-羥甲基糠醛高劑量組,蒼術(shù)苷A高劑量組,鞣質(zhì)低劑量組和聯(lián)合高、低劑量組5-HT4R表達(dá)水平均降低至與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05);5-羥甲基糠醛和蒼術(shù)苷A高劑量組以及聯(lián)合給藥高、低劑量組均恢復(fù)至與正常組無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(P0.05)。3結(jié)論3.1炒焦可增加蒼術(shù)化學(xué)成分的溶出率焦蒼術(shù)各提取部位浸膏得率均明顯高于生蒼術(shù),說明炒焦可增加蒼術(shù)所含化學(xué)成分的溶出率。3.2焦蒼術(shù)正丁醇提取部位是其“健脾止瀉”的主要藥效部位通過對(duì)生、焦蒼術(shù)各提取部位對(duì)脾虛泄瀉模型的藥效學(xué)研究,焦蒼術(shù)正丁醇部位在增強(qiáng)胃腸動(dòng)力、促進(jìn)消化,抑制消化道炎癥和促進(jìn)結(jié)腸對(duì)糞便水分重吸收等方面明顯強(qiáng)于其他提取部位。說明焦蒼術(shù)正丁醇提取部位是其發(fā)揮“健脾止瀉”的主要藥效部位。3.3 5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A和鞣質(zhì)是蒼術(shù)炒焦引起藥效改變的主要增量成分由生、焦蒼術(shù)正丁醇部位的HPLC指紋圖譜對(duì)比分析,的確存在顯著增量的色譜峰。通過對(duì)蒼術(shù)所含主要成分進(jìn)行含量測(cè)定,5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A、鞣質(zhì)含量在焦蒼術(shù)中顯著增高,且均具有較強(qiáng)的藥理活性。3.4 5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A、鞣質(zhì)協(xié)同調(diào)控胃腸功能紊亂5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A和鞣質(zhì)可通過增強(qiáng)胃和小腸動(dòng)力,抑制腸道過度增殖的條件致病菌,對(duì)抗消化道炎癥,下調(diào)結(jié)腸5-HT及其受體5-HT4R、5-HT7R的表達(dá)、恢復(fù)其正常運(yùn)動(dòng)功能,促進(jìn)結(jié)腸和抑制腎臟對(duì)水分的重吸收、使機(jī)體水液代謝恢復(fù)平衡,達(dá)到治療脾虛泄瀉證的目的。綜上,蒼術(shù)炒焦后5-羥甲基糠醛、蒼術(shù)苷A和鞣質(zhì)含量顯著增高,是焦蒼術(shù)長(zhǎng)于“健脾止瀉”的主要物質(zhì)基礎(chǔ),主要通過促進(jìn)MTL、GAS等胃腸激素分泌促進(jìn)胃腸蠕動(dòng),抑制腸道條件致病菌,對(duì)抗消化道炎癥,通過抑制腦腸神經(jīng)遞質(zhì)5-HT及其受體5-HT4R、5-HT7R的過高表達(dá),調(diào)節(jié)結(jié)腸運(yùn)動(dòng),促進(jìn)模型大鼠結(jié)腸AQP_3和抑制腎臟AQP_2的表達(dá),恢復(fù)機(jī)體正常的水液代謝通路,發(fā)揮“健脾止瀉”功效。
【學(xué)位授予單位】：湖北中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R284;R285
【圖文】：

且升高幅度均在 1 倍以上，另還有 2 種新成分產(chǎn)生；結(jié)果見圖4-1、表 4-2。圖 4-1 生蒼術(shù)（上）與焦蒼術(shù)（下）正丁醇萃取部位 HPLC 鏡像圖Fig. 4-1 HPLC image of extraction site with n-butanol between rawAtractylodes (top) andcokedAtractylodes (bottom) .

圖 4-2 生蒼術(shù) HPLC-DAD 色譜圖Fig.4-2 Chromatogram of RhizomaAtractylodis by HPLC-DAD.

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本文編號(hào)：2726349