【摘要】：生物堿是石斛屬植物中主要活性成分之一,現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明,石斛生物堿具有改善大腦記憶和認(rèn)知功能障礙的活性。霍山石斛是安徽省道地藥材、石斛類中國(guó)地理標(biāo)志保護(hù)產(chǎn)品。目前對(duì)霍山石斛生物堿的研究主要停留在總生物堿含量檢測(cè)層面,開(kāi)展霍山石斛生物堿組成分析及其神經(jīng)保護(hù)作用研究對(duì)于其保健功效開(kāi)發(fā)具有重要指導(dǎo)意義。因此,本研究以霍山石斛鮮條為原料,采用加熱浸提、液液萃取、固相萃取純化得到三種霍山石斛生物堿(分別命名為DHALE、DHALSE-2和DHALSE-3),借助HPLC-DAD、GC-MS及LC-QTOF-MS/MS對(duì)霍山石斛生物堿樣品的組成成分進(jìn)行分析,最后研究其對(duì)氧化損傷神經(jīng)細(xì)胞的預(yù)保護(hù)作用。主要研究結(jié)果如下:(1)霍山石斛總生物堿提取的最佳溶劑為酸性乙醇(70%EtOH,pH=3)。當(dāng)石斛凍干粉與酸性乙醇料液比1:25,80℃水浴浸提3次,每次2 h,提取得到的總生物堿含量為0.0371%(以凍干粉計(jì)),比95%乙醇提取者增加41.06%,相對(duì)三氯甲烷提取則提高了508.19%。(2)酸水堿化液液萃取方法可對(duì)霍山石斛酸性乙醇提取液中生物堿進(jìn)行有效富集及初步純化,且三種提取溶劑所得霍山石斛總生物堿組成成分類似。HPLC-DAD分析表明:經(jīng)過(guò)液液萃取后,石斛生物堿提取物液相色譜圖中0-7min中的基質(zhì)干擾峰可顯著減弱;GC-MS分析表明:液液萃取可除去石斛提取液中糖類、醚類和醇類等物質(zhì);HPLC-DAD及GC-MS分析證實(shí)三種溶劑(酸性乙醇、95%乙醇和三氯甲烷)提取的霍山石斛生物堿組成成分類似。(3)與鐵皮石斛或金釵石斛生物堿組成相比,霍山石斛生物堿組成具有特異性。使用HPLC-DAD對(duì)霍山石斛總生物堿提取物(DHALE)、金釵石斛總生物堿提取物(DNALE)和鐵皮石斛總生物堿提取物(DOALE)進(jìn)行檢測(cè),通過(guò)中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)對(duì)其高效液相色譜圖進(jìn)行分析。結(jié)果表明:金釵石斛、鐵皮石斛與霍山石斛的生物堿組成相似度的相關(guān)系數(shù)分別為0.564和0.435,此結(jié)果說(shuō)明霍山石斛生物堿組成成分與金釵石斛和鐵皮石斛相似度較低,霍山石斛具有自己的特有生物堿組成體系使用GC-MS對(duì)DHALE、DNALE和DOALE的檢測(cè)表明:霍山石斛生物堿有一種特征型生物堿為6-羥基石斛次堿,通過(guò)峰面積歸一化法計(jì)算其相對(duì)含量為58.15%。(4)霍山石斛提取物經(jīng)過(guò)液液萃取和固相萃取純化后,得到樣品DHALSE-2和DHALSE-3,LC-QTOF-MS/MS定性分析表明其主要含有6種生物堿類化合物。以PCX為吸附劑的固相萃取柱對(duì)霍山石斛生物堿提取物進(jìn)行分離純化時(shí),使用含有3%氨水的1:1甲醇/乙腈溶液為洗脫液,即可將霍山石斛生物堿完全洗脫,分別得到DHALSE-2和DHALSE-3。DHALSE-3中生物堿化合物分別為6-羥基石斛次堿(6-hydroxynobiline)、2-羥基石斛堿(2-hydroxydendrobine)、findlayine C、石斛堿(dendrobine)、石斛酮堿(nobilonine)和trans-dendrochrysanine;DHALSE-2中生物堿類分別為6-羥基石斛次堿,石斛酮堿和trans-dendrochrysanine。(5)DHALE、DHALSE-2和DHALSE-3對(duì)經(jīng)H_2O_2誘導(dǎo)氧化損傷的PC12細(xì)胞均有預(yù)保護(hù)作用,DHALSE-3的預(yù)保護(hù)效果優(yōu)于DHALE和DHALSE-2。
【學(xué)位授予單位】：合肥工業(yè)大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285;TQ464
【圖文】：

霍山石斛生物堿提取溶劑的篩選，提高霍山石斛總生物堿含量，這對(duì)霍山物堿后續(xù)分離純化研究具有重要意義。目前市場(chǎng)上僅有石斛堿一種石斛類生物堿標(biāo)準(zhǔn)品，直接對(duì)霍山石斛生物分析存在一定的難度。為此，本研究在采用 HPLC-DAD 和 GC-MS 技術(shù)對(duì)斛生物堿進(jìn)行組成分析時(shí)，以生物堿含量最高的金釵石斛、擬列入藥食同皮石斛生物堿組成作為參照，初步判斷霍山石斛生物堿組成的種屬特征性。 材料與儀器.1 主要原料原料：霍山石斛鮮條：三年生，安徽霍山縣長(zhǎng)沖中藥材開(kāi)發(fā)有限公司， cm，直徑 0.3-0.7 cm；鐵皮石斛鮮條：三年生，安徽霍山縣長(zhǎng)沖中藥材開(kāi)公司，莖長(zhǎng) 15-20 cm，直徑 0.5-0.8 cm；金釵石斛鮮條：三年生，購(gòu)于貴州市旺龍鎮(zhèn)云集種植基地莖長(zhǎng)莖長(zhǎng) 35-45 cm，直徑 0.5-1.8 cm。將石斛切成段于-80℃下冷凍 24 h 后，真空冷凍干燥 24 h，使用中藥粉碎機(jī)粉碎，過(guò) 100 石斛鮮條凍干粉。三種石斛鮮條形態(tài)如圖 2.1 所示。

表 2.2 試驗(yàn)儀器與設(shè)備（續(xù)）Tab 2.2 Test equipment and instruments名稱 型號(hào) 生產(chǎn)廠商 pH 計(jì) PB-10 德國(guó) Sartorius 公司干燥機(jī) FD - 2 北京博醫(yī)康試驗(yàn)儀器有限合儀 XW-80A 上海皓莊儀器有限公司光度計(jì) UV - 2600 上海美譜達(dá)儀器有限公色譜儀 Agilent 1260 美國(guó)安捷倫公司質(zhì)聯(lián)用儀 /SCION SQ 美國(guó)布魯克公司設(shè)計(jì)與試驗(yàn)方法方案設(shè)計(jì)

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2726292