【摘要】：馬齒莧(Portulaca oleracea L.)為馬齒莧科馬齒莧屬一年生草本植物,屬于藥食兩用中藥,具有清熱解毒、涼血止血、止痢的功效�，F(xiàn)代藥理研究表明馬齒莧具有抗菌、消炎、止血、抗氧化、抗衰老、耐缺氧、神經(jīng)保護、降血糖、降血脂等多種作用。如馬齒莧提取物對缺氧、魚藤酮、D-半乳糖/亞硝酸鈉和三氯化鋁誘導的神經(jīng)損傷具有保護作用;對耳腫脹、足腫脹、棉棒肉芽腫、潰瘍性結腸炎等非特異性炎癥、濕疹等變態(tài)反應炎癥等動物模型、以及脂多糖(LPS)激活的巨噬細胞炎癥等模型具有抗炎作用,但其神經(jīng)保護和抗炎藥效物質(zhì)基礎并不十分明確。一、馬齒莧酰胺E的神經(jīng)保護作用研究馬齒莧酰胺E(Oleracein E,OE)(8,9-二羥基-1,5,6,10b-四氫-2H-吡咯并[2,1-a]異喹啉-3-酮)為首次從馬齒莧中分離得到的具有兒茶酚四氫異喹啉/吡咯烷酮三環(huán)骨架的新型生物堿。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)OE(15mg/Kg)通過清除自由基、抑制脂質(zhì)過氧化、緩解氧化應激、抑制神經(jīng)細胞凋亡、抑制中腦和紋狀體ERK磷酸化等途徑,對大劑量D-半乳糖/亞硝酸鈉誘導的老年癡呆小鼠和魚藤酮誘導的帕金森病小鼠模型發(fā)揮神經(jīng)保護作用。OE對三氯化鋁誘導的老年癡呆動物模型和單純亞硝酸鈉誘導的記憶鞏固障礙動物模型是否具有神經(jīng)保護作用尚未有報道。1.本文利用腹腔注射三氯化鋁(40mg/Kg/d)28天建立腦氧化應激和神經(jīng)毒性昆明小鼠模型,以益智藥吡拉西坦(Piracetam,PA)為陽性對照,分別從體重、生存率、認知功能、器官指數(shù)、腦組織及血漿鋁含量、氧化應激相關生化指標和海馬組織形態(tài)學及凋亡相關蛋白表達等方面,首次評價了 OE(3 mg/Kg/d和15 mg/Kg/d)灌胃28天對三氯化鋁染毒小鼠的神經(jīng)保護作用。結果表明,三氯化鋁引起血和大腦中鋁離子含量顯著增高(p0.001,p0.01),使血和大腦中氧化應激水平顯著升高,如脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA顯著增高(p0.001,p0.01),腦中GSH含量代償性增高(p0.01),并且造成海馬神經(jīng)元細胞的損傷和海馬CAI、CA3 和 CA4 區(qū)促凋亡蛋白 Caspase-3 的表達升高(p0.001,p0.001,p0.001),以及海馬CA1和CA4區(qū)促凋亡蛋白Bax的表達升高(p0.01,p0.001),但并未造成小鼠空間學習和記憶能力的顯著損傷(p0.05)。紫外分光光度法表明OE可與鋁離子形成穩(wěn)定的螯合物;高劑量OE很可能通過螯合鋁離子造成小鼠腦鋁含量顯著高于模型組(0.01)進而使腦中毒性游離鋁的含量降低;OE在高劑量時通過調(diào)節(jié)SOD、CAT和GSH等氧化應激指標顯著降低了 MDA含量(p0.05),緩解了腦中的氧化應激;同時,與陽性對照PA類似,高低劑量OE可以顯著抑制三氯化鋁導致海馬CA4和CA1區(qū)的Caspase-3的表達升高(p0.05,p0.001),但對Bax表達無顯著影響(p0.05)。以上結果表明,OE作為抗氧化劑、鋁螯合劑和凋亡抑制劑,具有緩解三氯化鋁導致的小鼠腦內(nèi)氧化應激和神經(jīng)毒性的作用。2.本文首次評價了灌胃OE(3 mg/Kg/d和15 mg/Kg/d)56天對腹腔注射亞硝酸鈉(90mg/Kg/d)56天染毒昆明小鼠的影響。結果表明,亞硝酸鈉染毒可導致小鼠發(fā)生死亡,給藥第56天,模型組小鼠的生存率僅有70%,PA陽性藥物組小鼠的生存率為75%,而OE高劑量組與空白對照組均為85%,OE低劑量組的生存率為90%,各組小鼠生存率無顯著性差異(p0.05)。腹腔注射亞硝酸鈉造成大腦和血漿脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA顯著增加(p0.001,p0.05),但高鐵血紅蛋白含量并未發(fā)生顯著變化(p0.05),雖然引起少量的海馬神經(jīng)元細胞發(fā)生損傷,但損傷程度并不嚴重,而且其學習和記憶功能并未有顯著性損傷(p0.05),上述結果表明僅亞硝酸鈉(90 mg/Kg/d,56 days)單獨腹腔注射給藥雖然可以造成大腦產(chǎn)生一定的氧化應激,但尚不能造成老年癡呆小鼠模型。與亞硝酸鈉模型組小鼠比較:陽性藥物PA雖然顯著緩解了腦組織SOD活力的代償性增高0.05),但未能顯著的緩解亞硝酸鈉誘導的腦組織MDA含量升高(p0.05);低劑量OE組的腦組織GSH含量顯著增加(p0.05),然而高劑量OE對SOD和CAT活力以及GSH含量均未有顯著影響(p0.05),但高、低劑量OE均顯著降低了腦和血中的MDA水平(p0.01,p0.01;p0.01,p0.001),由于前期實驗表明酚性生物堿OE具有很強的體外清除DPPH自由基和ROS的能力,推測OE直接清除腦組織ROS可能與其降低腦脂質(zhì)過氧化水平密切相關。二、馬齒莧提取物及馬齒莧酰胺E對脂多糖(LPS)誘導膿毒癥小鼠的抗炎活性研究膿毒癥是由病原微生物入侵機體感染導致的全身炎癥反應綜合征。清熱解毒中藥在拮抗內(nèi)毒素、減少炎癥介質(zhì)、治療膿毒癥方面發(fā)揮著重要作用。利用革蘭氏陰性菌細胞壁組分脂多糖LPS(又稱內(nèi)毒素)誘導的RAW264.7小鼠巨噬細胞炎癥模型以及膿毒癥小鼠模型已成為抗炎藥物研究的重要模型。大量研究表明,清熱解毒中藥馬齒莧的提取物可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞炎性因子TNF-α、IL-6和NO的過量釋放;同時本課題組前期發(fā)現(xiàn)OE等四氫異喹啉生物堿可顯著抑制LPS誘導的RAW264.7巨噬細胞中NO的過量釋放;但馬齒莧提取物及其單體化合物對LPS誘導的膿毒癥小鼠體內(nèi)模型是否有抗炎作用尚未有報道。因此,本文通過單劑量腹腔注射LPS(5mg/Kg)8h建立了膿毒癥昆明小鼠模型,并首次分別對灌胃給藥馬齒莧醇水提取物(PAAs)(250、500、1000和4000mg/Kg)、PAAs所含的總有機酸提取物(Acid)(50、100、400和1000mg/Kg)、以及OE(5、15和45 mg/Kg)的抗炎活性進行了評價。研究結果表明,與空白對照組相比,單劑量腹腔注射LPS會造成昆明小鼠眼瞼分泌物增多、精神萎靡、活動減少,并導致血漿NO(p0.001)、TNF-α(p0.001)和IL-6(p0.001)炎性因子水平顯著升高,血漿谷草轉氨酶(AST)和谷丙轉氨酶(ALT)活性升高(p0.001,p0.01)。(1)PAAs在500～4000 mg/Kg時顯著抑制膿毒癥小鼠血漿NO水平(p0.05),在1000～4000 mg/Kg時顯著抑制TNF-α(p0.05)和IL-6(p0.05)含量的升高,與陽性對照地塞米松(5 mg/Kg)的抗炎活性一致。(2)Acid在50～1000 mg/Kg時可劑量依賴性地顯著降低膿毒癥小鼠血漿NO含量(p0.05),以及IL-6的含量(p0.01),但對iNOS活性無影響(p0.05),在400～1000 mg/Kg時顯著抑制膿毒癥小鼠血漿TNF-α含量(p0.05),并在100～400 mg/Kg時顯著降低血漿AST和ALT活性(p0.05,p0.01;p0.01,,p0.001),緩解了膿毒癥小鼠的急性炎癥反應。利用氣質(zhì)聯(lián)用法對Acid的甲酯化產(chǎn)物進行分析,初步確定了Acid所含的8個主要成分,分別為丁二酸、苯甲酸、蘋果酸、檸檬酸、4-羥基肉桂酸、阿魏酸、二十酸和二十一酸。(3)OE在15～45 mg/Kg時可以顯著抑制膿毒癥小鼠血漿NO過量釋放(p0.01),但對膿毒癥小鼠血漿中TNF-α和IL-6含量無顯著影響(p0.05)�？紤]到體外實驗發(fā)現(xiàn)PAAs、Acid和OE對NO2-有較強的直接清除作用,推測這可能與其顯著抑制膿毒癥小鼠NO過度釋放密切相關。上述研究結果表明總有機酸是馬齒莧緩解LPS誘導的膿毒癥小鼠急性炎癥反應的有效部位,但以OE為代表的四氫異喹啉生物堿是否是清熱解毒中藥馬齒莧中的抗炎活性成分仍有待深入評價和確證。
【學位授予單位】：山東大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2725782