【摘要】：目的研究淡豆豉(Sojae Semen Praeparatum)的抗抑郁作用與γ-氨基丁酸(γ-amino butyric acid,GABA)含量的關(guān)系,分析淡豆豉炮制過(guò)程中高富集GABA的影響因素,為科學(xué)闡釋淡豆豉的“除煩”功效和揭示淡豆豉炮制中GABA形成機(jī)理奠定基礎(chǔ)。方法1、本實(shí)驗(yàn)室前期參照2015版《中國(guó)藥典》已建立規(guī)范的淡豆豉炮制工藝,本研究按此炮制工藝制備淡豆豉,獲取各炮制不同時(shí)間點(diǎn)樣本。2、應(yīng)用慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激(Chronic unpredictable mild stress,CUMS)抑郁模型,研究淡豆豉的抗抑郁作用與GABA含量的關(guān)系。(1)GABA含量測(cè)定:應(yīng)用本課題組前期建立的柱前在線衍生高效液相色譜技術(shù)(HPLC-OPA)測(cè)定淡豆豉炮制過(guò)程中不同時(shí)間點(diǎn)樣本的GABA含量。(2)CUMS抑郁模型制備:100只昆明小鼠(Kunming mice,KM)按體重隨機(jī)分為空白組、模型組、鹽酸氟西汀組、GABA組、黑大豆組、發(fā)酵6 d組、再悶6 d、組、再悶15 d高、中、低劑量組。每組10只,雌雄各半。每只單籠飼養(yǎng)。連續(xù)28天,按每天1種或2種刺激隨機(jī)交替建立CUMS抑郁小鼠模型。除空白對(duì)照組外,其余各組均采取單籠飼養(yǎng)及以下慢性應(yīng)激刺激:禁食24 h,禁水24 h,潮濕墊料24 h,夾尾1 min(以小鼠發(fā)出哀鳴聲為宜),45℃熱水游泳3 min,斜籠24 h,4℃冷水刺激3 min,震蕩2 min,通宵照明24 h,共9種刺激每天隨機(jī)選取一種應(yīng)激,持續(xù)應(yīng)激28 d,使小鼠無(wú)法預(yù)知將要給予的應(yīng)激。具體安排如下:第1、11、20 d為禁水;第2、10、21、28 d夾尾;第3、12、19 d為潮濕墊料;第4、13、24 d為熱刺激;第5、15、22 d為禁食;第6、16、23 d為斜籠;第7、14、26 d為冷刺激;第8、18、27 d為通宵照明;第9、17、25 d為震蕩。造模同時(shí)連續(xù)灌胃給藥28 d,觀察體重、懸尾、強(qiáng)迫游泳、敞箱、糖水偏好等行為學(xué)指標(biāo)的變化。3、淡豆豉炮制過(guò)程中影響GABA富集的主次因素初步分析應(yīng)用相關(guān)性分析、多元回歸分析等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法,分析淡豆豉炮制中pH、溫度、水分、蛋白酶(酸、中、堿性)和谷氨酸脫羧酶(Glutamic acid decarboxylase,GAD)各指標(biāo)在GABA形成中的主次地位。(1)淡豆豉炮制過(guò)程中相關(guān)指標(biāo)的檢測(cè):利用pH計(jì)、溫度計(jì)、干燥失重法、福林酚法及Berthelot顯色法分別測(cè)定淡豆豉炮制過(guò)程中pH、溫度、水分、蛋白酶和GAD等指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化,應(yīng)用柱前在線衍生HPLC-OPA方法測(cè)定淡豆豉炮制過(guò)程中GABA的動(dòng)態(tài)變化。(2)統(tǒng)計(jì)學(xué)方法分析:以淡豆豉炮制過(guò)程中各個(gè)指標(biāo)含量為橫坐標(biāo),以相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)樣本的GABA含量為縱坐標(biāo)作散點(diǎn)圖,并進(jìn)行相關(guān)性分析和線性回歸分析。用Pearson相關(guān)系數(shù)分別對(duì)各指標(biāo)與GABA含量的相關(guān)性進(jìn)行評(píng)價(jià),用雙尾檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)顯著水平。用R~2對(duì)線性回歸模型進(jìn)行評(píng)價(jià),F檢驗(yàn)法評(píng)價(jià)其回歸方程的顯著性。在此基礎(chǔ)上建立多元回歸方程,通過(guò)比較各因素系數(shù)絕對(duì)值的大小,明確各指標(biāo)在GABA形成中的主次地位。4、淡豆豉炮制中產(chǎn)GABA微生物的產(chǎn)GAD能力分析根據(jù)淡豆豉炮制過(guò)程中影響GABA形成的主要因素,研究各優(yōu)勢(shì)微生物在不同pH和溫度下產(chǎn)GAD的能力。結(jié)果1、按本實(shí)驗(yàn)室前期建立的淡豆豉炮制工藝制備淡豆豉,獲得以下不同時(shí)間點(diǎn)樣本:黑大豆(H)、“黃衣上遍”階段為發(fā)酵0、3、6 d(分別記為F0、F3、F6)“再悶”階段為再悶3、6、9、12、15 d(分別記為Z3、Z6、Z9、Z12、Z15),成品性狀:表面黑色,皺縮不平,質(zhì)柔軟,斷面棕黑色,氣濃郁,味微甘。樣品性狀和各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合2015版《中國(guó)藥典》要求。2、淡豆豉的抗抑郁作用及其與GABA含量的關(guān)系(1)各藥物組中GABA含量:按前期建立的發(fā)酵炮制工藝獲取淡豆豉炮制不同時(shí)間點(diǎn)樣品,并測(cè)定樣品煎煮液中GABA含量,此次運(yùn)用柱前在線衍生色譜技術(shù)在黑大豆和發(fā)酵6 d中未檢測(cè)出GABA,再悶6 d和再悶15 d的GABA含量分別為5.559 mg/g、8.421 mg/g。(2)淡豆豉抗抑郁作用與GABA的關(guān)系:采用單籠飼養(yǎng)加慢性溫和不可預(yù)知性應(yīng)激復(fù)制抑郁模型,連續(xù)給藥28 d后,各行為學(xué)指標(biāo)變化如下:與空白組比較,模型組的體重、糖水偏好、跨格數(shù)和直立數(shù)均減少(p0.01);懸尾及游泳不動(dòng)時(shí)間增加(p0.05);表明CUMS抑郁模型建造成功。與模型組比較,體重:造模前各組均無(wú)差異(p0.05),造模后鹽酸氟西汀組、GABA組、再悶6 d組、再悶15 d高、中劑量均增加(p0.05),黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組無(wú)差異(p0.05);糖水偏好:造模前各組間無(wú)差異(p0.05),造模后陽(yáng)性藥組、GABA組、再悶6 d組(p0.01)及再悶15 d高、中劑量(p0.05)均增加,黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組均無(wú)差異(p0.05);敞箱實(shí)驗(yàn):造模前各組的跨格數(shù)、直立數(shù)均無(wú)差異(p0.05),造模后陽(yáng)性藥組、GABA組、再悶6 d組、再悶15 d高、中劑量跨格數(shù)增多(p0.01),黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組均無(wú)差異(p0.05);陽(yáng)性藥組、GABA組(p0.01)、再悶15 d高劑量組(p0.05)的直立數(shù)增加,黑大豆組、發(fā)酵6 d組、再悶6 d組及再悶15 d中、低劑量組均無(wú)差異(p0.05)。懸尾實(shí)驗(yàn):陽(yáng)性藥組、GABA組、再悶6 d組及再悶15 d高、中劑量組不動(dòng)時(shí)間均減少(p0.01),黑大豆組、發(fā)酵6 d組及再悶15 d低劑量組均無(wú)差異(p0.05)。強(qiáng)迫游泳實(shí)驗(yàn):各組游泳不動(dòng)時(shí)間均縮短(p0.01)。3、淡豆豉炮制過(guò)程中影響GABA富集的主次因素(1)淡豆豉炮制過(guò)程中各指標(biāo)的動(dòng)態(tài)變化:(1)GABA含量:在炮制前原料黑大豆中含有微量GABA,進(jìn)入“黃衣上遍”階段未檢測(cè)出GABA,洗去黃衣進(jìn)入“再悶”階段后,GABA含量逐漸增加,至再悶15 d后含量穩(wěn)定。(2)pH值:淡豆豉炮制過(guò)程中pH值總體處于偏弱酸性呈現(xiàn)先增后減的趨勢(shì)。(3)溫度:炮制體系的溫度呈逐漸下降的趨勢(shì),在“黃衣上遍”初始階段溫度最高。(4)水分:水分在“黃衣上遍”階段逐漸降低,進(jìn)入再悶階段后逐漸增加后趨于穩(wěn)定。(5)蛋白酶:淡豆豉炮制過(guò)程中酸、中、堿性蛋白酶均呈現(xiàn)先減后增再減的趨勢(shì),酸性、中性蛋白酶及堿性蛋白酶最高分別達(dá)11.88 U/g、116.56 U/g和69.20 U/g。(6)GAD:GAD活性總體呈現(xiàn)先減后增,于再悶15 d時(shí)活性高達(dá)17.64 U/g。(2)淡豆豉炮制中GABA富集的主次因素:淡豆豉炮制過(guò)程中水分和酸性蛋白酶與GABA相關(guān)性系數(shù)分別為0.211和-0.340,p值分別為0.324和0.228,相關(guān)性較小且無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)差異;比較回歸系數(shù)絕對(duì)值的大小可知,其它各指標(biāo)在GABA形成中的主次地位為pH(-0.375)溫度(-0.284)GAD(0.140)堿性蛋白酶(0.047)中性蛋白酶(-0.030),其中pH、溫度和中性蛋白酶與GABA具有負(fù)相關(guān)性,GAD活力和堿性蛋白酶與GABA存在正相關(guān)性。4、淡豆豉炮制中產(chǎn)GABA微生物的產(chǎn)GAD能力:枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)Xd_3和鳥腸球菌(Enterococcus avium)15R_3在pH=6.0、溫度為34℃時(shí)產(chǎn)GAD活力最高,此時(shí)GAD酶活分別達(dá)19.43 U/h和11.18 U/h;屎腸球菌(Enterococcus faecium)15r_1在pH為5、溫度為31℃時(shí)產(chǎn)GAD能力最高,酶活達(dá)3.41 U/h;極細(xì)支孢霉(Cladosporium cladosporioides)ME_4在pH為4、溫度為28℃時(shí)產(chǎn)GAD較強(qiáng),酶活為11.50 U/h;黃曲霉(Aspergillus flavus)MB_2和桔青霉(Penicillium citrinum)ME_3均是在pH為7、溫度為28℃時(shí)產(chǎn)GAD能力最高,酶活分別為41.97、3.44 U/h;黑曲霉(Aspergillus niger)JD_2在pH為7、溫度為31℃時(shí)最適產(chǎn)GAD,酶活為25.78 U/h;溜曲霉(Aspergillus tamarii)MA_3在pH為8、溫度為28℃時(shí)最適產(chǎn)GAD,酶活為12.49 U/h;白腐菌(Phanerochaete sordida)MG_1在pH為6、溫度為25℃時(shí)最適產(chǎn)GAD,酶活達(dá)15.74 U/h。結(jié)論1.本實(shí)驗(yàn)按前期建立的淡豆豉炮制工藝制備淡豆豉其成品性狀和各項(xiàng)理化指標(biāo)均符合2015版《中國(guó)藥典》要求。2.本研究首次運(yùn)用經(jīng)典的CUMS抑郁模型來(lái)評(píng)價(jià)淡豆豉的除煩作用,結(jié)果表明淡豆豉對(duì)模型小鼠的抑郁行為有較好改善作用,抗抑郁作用與樣本的GABA含量有關(guān),為后期進(jìn)一步明確淡豆豉除煩功效的物質(zhì)基礎(chǔ)提供依據(jù)。3.淡豆豉炮制過(guò)程中pH、溫度、GAD、中性及堿性蛋白酶等指標(biāo)對(duì)GABA的形成有重要的影響,其主次順序?yàn)閜H溫度GAD堿性蛋白酶中性蛋白酶。4.淡豆豉炮制過(guò)程中各優(yōu)勢(shì)菌種最適產(chǎn)GAD的條件也不盡相同,各菌株最適產(chǎn)GAD的條件與淡豆豉自然炮制條件范圍相吻合,為進(jìn)一步闡明淡豆豉炮制過(guò)程中GABA動(dòng)態(tài)變化的機(jī)制奠定基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：江西中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
【圖文】：
3. 結(jié)果與分析3.0 淡豆豉炮制不同時(shí)間點(diǎn)樣品性狀本實(shí)驗(yàn)室結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)和歷版《中國(guó)藥典》建立了規(guī)范的淡豆豉炮制工藝，按此工藝制備淡豆豉。淡豆豉炮制不同時(shí)間點(diǎn)樣品見圖 1-1，淡豆豉炮制 0-6 d為“黃衣上遍”階段， 此過(guò)程豆粒逐漸長(zhǎng)滿黃衣，待發(fā)酵至第 6 d 時(shí)“黃衣上遍”；洗去黃衣進(jìn)入“再悶”階段，“再悶”階段豆粒逐漸皺縮不平，體積縮小且質(zhì)軟，伴有一定的酒香氣味。
分組 第 0 d 第 7 d 第 14 d 第 21 d 第 28 d模型組 23.88±1.72 26.33±2.83△△28.51±3.59△△30.75±3.46△△29.62±2.28△△空白組 23.82±1.93 30.10±3.56**34.06±4.87**35.91±5.18**37.37±5.16**陽(yáng)性藥物組 23.83±2.22 29.48±2.19*32.95±3.30**34.87±3.98*33.49±3.59*GABA 組 23.92±1.46 29.26±1.73*32.44±2.25*35.08±3.14*33.50±2.13*H 組 23.58±1.93 28.38±2.42 31.20±3.12 32.77±2.50 31.87±2.91F6 組 23.83±1.85 27.87±2.66 30.51±3.29 32.74±3.69 31.73±3.43Z6 組 23.96±1.92 29.10±3.14*32.25±3.47*34.68±3.72*32.93±2.91*高劑量 24.00±1.80 28.07±3.64 31.63±4.11 34.49±4.43*32.93±5.18*Z15 中劑量 23.64±1.70 28.68±3.65 31.97±3.95* 34.88±4.34*33.26±3.69*低劑量 24.08±1.77 29.06±3.67 31.58±4.17 34.36±4.61 32.85±3.99注：與模型組比較，*p<0.05，**p<0.01；與空白組比較，△p<0.05，△△p<0.01
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本文編號(hào)：
2725094
