【摘要】：選題依據(jù):隨著人口老齡化趨勢(shì)的逐漸加劇,如何安全有效地提高老年人的生活質(zhì)量,優(yōu)化其健康和社會(huì)醫(yī)療保障等過(guò)程,甚至延緩衰老已經(jīng)變得尤為重要,并逐漸成為人們關(guān)注的焦點(diǎn)。衰老是一種機(jī)體組織或器官退行性變化的不可避免的自然規(guī)律,它能夠影響老年人群的生活質(zhì)量,降低其免疫力進(jìn)而損害其健康,甚至威脅到老年人的生命。因此,如何安全有效的延緩衰老也變得日益迫切。但是近年來(lái)在衰老及抗衰老相關(guān)研究中并沒(méi)有取得較大的進(jìn)展,目前仍未發(fā)現(xiàn)安全、有效的抗衰老藥物。然而,隨著中藥現(xiàn)代化研究的不斷推進(jìn)與發(fā)展,藥食同源類(lèi)中藥在衰老研究中得到了廣泛的關(guān)注。甘草作為一種藥食兩用植物,已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于醫(yī)療保健和各類(lèi)食品中。甘草作為一種傳統(tǒng)的補(bǔ)益中草藥,具有補(bǔ)脾益氣、潤(rùn)肺止咳等多種藥理作用和生物學(xué)功能�，F(xiàn)代研究表明甘草具有抗炎、抗病毒、抗氧化、增強(qiáng)機(jī)體免疫力等藥理作用,甘草主要活性成分甘草酸、甘草素、甘草苷等具有抗氧化、神經(jīng)保護(hù)和改善認(rèn)知功能等作用。研究者認(rèn)為抗氧化作用有助于延緩衰老,許多研究結(jié)果也表明補(bǔ)充抗氧化劑可以減輕年齡相關(guān)的認(rèn)知障礙,延緩衰老過(guò)程。雖然大量的證據(jù)表明甘草具有顯著的抗氧化作用,但鮮有研究探究甘草在衰老相關(guān)模型中的抗衰老作用�；谝陨侠碚摶A(chǔ),我們推測(cè)甘草具有抗衰老作用。研究表明D-半乳糖誘導(dǎo)的亞急性大鼠衰老模型和自然衰老的大鼠具有較多的相似特征,特別是氧化應(yīng)激損傷和學(xué)習(xí)記憶功能障礙。當(dāng)長(zhǎng)期給予D-半乳糖溶液后,使得機(jī)體產(chǎn)生大量的自由基,進(jìn)而誘導(dǎo)機(jī)體處于過(guò)氧化狀態(tài),進(jìn)一步導(dǎo)致神經(jīng)功能障礙和學(xué)習(xí)記憶能力的降低。此外,高濃度的D-gal溶液在機(jī)體會(huì)被氧化成醛糖和過(guò)氧化氫,進(jìn)一步形成氧自由基、超氧陰離子,可以與蛋白質(zhì)和多肽在無(wú)酶參與的作用下形成穩(wěn)定的共價(jià)加成化合物晚期糖基化終末產(chǎn)物(AGEs),使蛋白質(zhì)和多肽的空間結(jié)構(gòu)發(fā)生變化,從而導(dǎo)致其生理活性和生理功能發(fā)生變化,促進(jìn)大鼠產(chǎn)生神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)退行性病變。因此,長(zhǎng)時(shí)間給予大鼠D-gal溶液能夠使其產(chǎn)生類(lèi)自然衰老特征。代謝組學(xué)作為一種新的系統(tǒng)生物學(xué)技術(shù),已經(jīng)廣泛的應(yīng)用于研究機(jī)體受到外界因素干擾時(shí)內(nèi)源性代謝物水平的變化,是研究小分子代謝物在體內(nèi)代謝過(guò)程中動(dòng)態(tài)變化的一種新方法,是生物體系整體功能或狀態(tài)的最終結(jié)果表現(xiàn)。并借助多元統(tǒng)計(jì)分析進(jìn)一步分析內(nèi)源性代謝物的變化,進(jìn)而探究藥物或者其他外源性因素干擾機(jī)體的生理、病理變化機(jī)制。目的:本研究基于D-gal致大鼠衰老模型對(duì)甘草水提物的抗衰老藥效進(jìn)行評(píng)價(jià),并采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)其抗衰老作用機(jī)制進(jìn)行探究。方法:(1)實(shí)驗(yàn)大鼠分組、衰老模型建立和給藥:以SPF級(jí)雄性SD大鼠為研究對(duì)象,采用D-半乳糖溶液復(fù)制衰老大鼠模型;實(shí)驗(yàn)分為5組,即對(duì)照組、模型組和甘草水提物低、中、高劑量(1、5、10 g/kg)組;模型的建立采用連續(xù)腹腔注射給予D-半乳糖溶液(300 mg/kg)5周,對(duì)照組腹腔注射相應(yīng)劑量的生理鹽水,各給藥組則在造模同時(shí)灌胃給予相應(yīng)劑量的甘草水提物。(2)藥效學(xué)評(píng)價(jià):通過(guò)Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)評(píng)價(jià)衰老大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力。行為學(xué)結(jié)束后,采用4%水合氯醛將大鼠麻醉并處死,收集血清和組織樣本。采用蘇木精-伊紅染色(HE染色)觀察其海馬組織和肝組織的損傷程度。采用試劑盒測(cè)定海馬組織和肝組織的丙二醛(MDA)水平,超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(GSH-Px)活性,并測(cè)定海馬組織中的乙酰膽堿酯酶(AChE)活性和乙酰膽堿(ACh)水平變化。采用Western blot實(shí)驗(yàn)測(cè)定海馬組織中凋亡相關(guān)蛋白Cyt-c、Caspase-3、Bax和Bcl-2的表達(dá)水平。(3)代謝組學(xué)分析:行為學(xué)結(jié)束后,收集其12h尿液;然后采用4%水合氯醛麻醉大鼠,經(jīng)股動(dòng)脈取血并收集組織樣本。然后采用代謝組學(xué)技術(shù)對(duì)肝臟組織、血清、尿液進(jìn)行代謝組學(xué)分析。首先采用無(wú)監(jiān)督模式的主成分分析(Principal8component analysis,PCA)對(duì)大鼠肝臟組織、血清和尿液樣本的代謝輪廓及其變化規(guī)律進(jìn)行分析;然后以正交-偏最小二乘判別分析(Orthogonal signal correction filtered partial least squares discrimination analysis,OPLS-DA)結(jié)合“S-plot”尋找肝臟組織、血清和尿液中的差異代謝物,然后篩選出與衰老相關(guān)的潛在診斷標(biāo)志物。(4)靶標(biāo)代謝通路定量分析:通過(guò)對(duì)相應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行MetPA分析,篩選出這些診斷標(biāo)志物相應(yīng)的代謝通路,已尋找出與衰老過(guò)程相關(guān)的靶標(biāo)代謝通路。然后采用酶聯(lián)免疫反應(yīng)試劑盒對(duì)其相應(yīng)的潛在生物標(biāo)志物進(jìn)行定量分析,并對(duì)該代謝通路相應(yīng)的關(guān)鍵酶進(jìn)行定量分析。結(jié)果:(1)成分分析:基于LC-MS對(duì)甘草水提物的化學(xué)成分進(jìn)行分析,總共指認(rèn)出21個(gè)化合物;(2)藥效學(xué)結(jié)果:行為學(xué)結(jié)果顯示D-gal導(dǎo)致了模型組大鼠認(rèn)知功能顯著性下降(p0.05),表明衰老大鼠模型復(fù)制成功,當(dāng)給予甘草水提物后,其學(xué)習(xí)記憶功能明顯得到改善(p0.01);肝臟HE染色結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組大鼠肝臟組織出現(xiàn)了明顯的壞死性空洞,肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)明顯被損傷、變性和壞死。當(dāng)給予甘草水提物后,各給藥組的HE染色結(jié)果均得到顯著性改善,表明甘草水提物具有肝保護(hù)作用。海馬組織經(jīng)HE染色后,與空白組相比,D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠海馬神經(jīng)元排列紊亂,海馬CA1區(qū)出現(xiàn)大面積的神經(jīng)元壞死,胞質(zhì)嗜酸性增強(qiáng),細(xì)胞核固縮、溶解、消失。當(dāng)給予甘草水提物后,各給藥組的海馬HE染色結(jié)果均得到顯著性改善,表明甘草水提物具有神經(jīng)保護(hù)作用。肝臟組織和海馬組織中氧化應(yīng)激和膽堿能系統(tǒng)功能相關(guān)指標(biāo)測(cè)定結(jié)果顯示,衰老大鼠肝臟組織和海馬組織中SOD、GPx和CAT活性和ACh含量顯著性下降,AChE活性和MDA含量顯著性升高,表明D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠肝臟和海馬組織處于過(guò)氧化應(yīng)激狀態(tài),并且膽堿能功能發(fā)生紊亂。當(dāng)給予甘草水提物后,SOD、GSH-Px和CAT活性和ACh含量顯著性升高,AChE活性和MDA含量顯著性下降,表明甘草水提物具有明顯的抗氧化作用和調(diào)節(jié)膽堿能系統(tǒng)的作用。海馬組織的Western blot實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示,與空白組相比,衰老大鼠海馬組織中Bax/Bcl-2比值,Caspase-3和Cyt-C蛋白表達(dá)量均顯著性升高(p0.05),表明D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠海馬組織出現(xiàn)明顯的凋亡壞死;當(dāng)給予甘草水提物后,Bax/Bcl-2比值和Caspase-3和Cyt-C蛋白表達(dá)量顯著性(p0.05)降低,表明甘草水提物具有抑制神經(jīng)元凋亡和神經(jīng)保護(hù)作用。(3)代謝組學(xué)研究結(jié)果:肝臟代謝組學(xué)結(jié)果顯示,對(duì)照組與模型組PCA圖和OPLS-DA圖能夠明顯分開(kāi),表明D-gal導(dǎo)致模型組大鼠內(nèi)源性代謝物發(fā)生了明顯改變。為了進(jìn)一步探究甘草水提物是否對(duì)D-gal導(dǎo)致的代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用,對(duì)所有組別進(jìn)行OPLS-DA分析,結(jié)果顯示對(duì)照組、模型組和各給藥組之間都能最大程度分開(kāi),且給藥組具有明顯回調(diào)趨勢(shì)。為了尋找其潛在差異代謝物,本實(shí)驗(yàn)通過(guò)S-plot和VIP值尋找差異代謝物并對(duì)其進(jìn)行t檢驗(yàn)分析,共確定13個(gè)潛在生物標(biāo)記物:α-葡萄糖、磷脂酰乙醇胺、糖原、肌酸、甜菜堿、纈氨酸、3-羥丁酸、膽堿、谷胱甘肽、甘氨酸、琥珀酸、�；撬岷土字Ｄ憠A。其代謝通路富集分析結(jié)果依次是:(1)�；撬岽x;(2)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸的生物合成;(3)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;(4)丙氨酸、天門(mén)冬氨酸和谷氨酸代謝。血清代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示,對(duì)照組與模型組PCA圖和OPLS-DA圖能夠明顯分開(kāi),表明D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠血清代謝輪廓發(fā)生顯著性改變。為了進(jìn)一步探究甘草水提物是否對(duì)D-gal導(dǎo)致的代謝紊亂具有調(diào)節(jié)作用,對(duì)所有組別進(jìn)行OPLS-DA分析,結(jié)果顯示對(duì)照組、模型組和各給藥組之間都能最大程度分開(kāi),且給藥組具有明顯回調(diào)趨勢(shì)。通過(guò)S-plot和VIP值尋找差異代謝物,共確定13個(gè)潛在生物標(biāo)記物:異亮氨酸、亮氨酸、纈氨酸、丙氨酸、醋酸、谷氨酸、丙酮酸、檸檬酸、α-酮戊二酸、TMAO、胱氨酸、�；撬岷透拾彼帷Ｆ浯x通路富集分析結(jié)果依次是:(1)纈氨酸、亮氨酸和異亮氨酸代謝;(2)�；撬岽x;(3)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;(4)乙醛酸鹽代謝;(5)丙酮酸代謝;(6)檸檬酸循環(huán)(TCA循環(huán));(7)糖酵解和糖異生作用。尿液代謝組學(xué)分析結(jié)果顯示,對(duì)照組和模型組的PCA和OPLS-DA能夠明顯分開(kāi),表明D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠血清代謝輪廓發(fā)生顯著性改變。所有組的OPLS-DA分析結(jié)果顯示,對(duì)照組、模型組和各給藥組之間都能最大程度分開(kāi),且給藥組具有明顯回調(diào)趨勢(shì)。通過(guò)S-plot和VIP值尋找差異代謝物,共確定14個(gè)潛在生物標(biāo)記物:甘氨酸、肌酐、乳酸、�；撬�、胍基乙酸、N-甲基煙酰胺、α-葡萄糖、檸檬酸、富馬酸、肌酸、二甲基甘氨酸、α-酮戊二酸、乙酸和丙氨酸。其代謝通路富集分析結(jié)果依次是:(1)�；撬岽x;(2)甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝;(3)乙醛酸鹽代謝。(4)靶標(biāo)代謝通路定量分析:�；撬岽x通路在肝臟、血清和尿液分析中均與衰老具有顯著性相關(guān)性。采用酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定�；撬岷考按x相關(guān)的關(guān)鍵酶變化。�；撬岷繙y(cè)定結(jié)果顯示,在模型組大鼠血清和尿液中�；撬崴斤@著性下降(p0.01),當(dāng)給予甘草水提物后,衰老大鼠血清和尿液中的�；撬岷烤@著性回調(diào)(p0.05)。I型半胱氨酸雙加氧酶(cysteine dioxygenase,type I,CDO1)、半胱氨亞磺酸脫羧酶(Cysteinesulfinic acid decarboxylase,CSAD)和I型谷氨酸脫羧酶(glutamate decarboxylase,type I,GAD1)均在牛磺酸合成中發(fā)揮主要作用。酶聯(lián)免疫吸附法測(cè)定血清中CDO1、CSAD和GAD1活性結(jié)果顯示,與空白組相比,模型組中CDO1(p0.01)、CSAD(p0.01)和GAD1(p0.01)活性均顯著性降低;當(dāng)給予甘草水提物后,CDO1(p0.01)和CSAD(p0.01)活性顯著性回調(diào),表明甘草水提物能夠顯著性調(diào)節(jié)�；撬岷铣�。結(jié)論:(1)甘草水提物能夠顯著性改善D-gal誘導(dǎo)的衰老大鼠認(rèn)知功能損傷和氧化應(yīng)激損傷,并具有調(diào)節(jié)膽堿功能紊亂和抑制細(xì)胞的凋亡作用。(2)代謝組學(xué)研究結(jié)合多元統(tǒng)計(jì)分析發(fā)現(xiàn)�；撬岽x通路與D-gal誘導(dǎo)的大鼠衰老具有顯著性相關(guān)性。(3)代謝通路驗(yàn)證結(jié)果顯示甘草水提物能夠明顯改善機(jī)體�；撬岷铣�,表明甘草水提物發(fā)揮抗衰老作用可能是通過(guò)調(diào)節(jié)�；撬岷铣蓙�(lái)發(fā)揮作用的。
【學(xué)位授予單位】：山西大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類(lèi)號(hào)】：R285.5
【圖文】：

甘草水提物L(fēng)C-MS正離子模式（A）和負(fù)離子模式（B）總離子流圖

4.1 各組實(shí)驗(yàn)大鼠的體重變化 (n=15；與模型組比較：**p＜0.宮實(shí)驗(yàn)和新物體識(shí)別實(shí)驗(yàn)憶功能衰退是衰老過(guò)程中伴隨的常見(jiàn)現(xiàn)象，是一種腦功能 Morris 水迷宮實(shí)驗(yàn)對(duì)實(shí)驗(yàn)大鼠的空間學(xué)習(xí)記憶功能進(jìn)行D-半乳糖誘導(dǎo)的衰老大鼠潛伏期較空白組顯著性（p<0.0平臺(tái)次數(shù)（圖 4.2B）和目標(biāo)象限停留時(shí)間（圖 4.2C）較

【參考文獻(xiàn)】

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本文編號(hào)：2717481