【摘要】：1研究目的1.1研究水蛭生品、滑石粉燙制品、酒炙品抗凝血活性差異,為水蛭的臨床應用提供參考依據。1.2研究炮制對水蛭蛋白的影響,采用統(tǒng)計學方法分析主要的差異蛋白,為水蛭生品及其炮制品的藥效物質研究提供參考依據。1.3研究炮制對水蛭表面真菌的影響,找出水蛭生品及其炮制品表面的優(yōu)勢菌群,為水蛭的質量控制提供參考依據。2研究內容與研究方法2.1樣品收集在河北安國藥材市場收集清水吊干水蛭藥材10批,密封,4℃保存?zhèn)溆谩?.2水蛭炮制按照2015版《中國藥典》通則(0213)規(guī)定對水蛭藥材進行酒炙和滑石粉燙制。2.3水蛭及其炮制品抗凝血活性檢測按照2015版《中國藥典》水蛭含量測定項下規(guī)定的滴定法及活化部分凝血酶時間(APTT)、凝血酶原時間(PT)、凝血酶時間(TT)對水蛭生品及其炮制品的抗凝血活性進行評價。2.4水蛭生品及其炮制品蛋白質檢測2.4.1SDS-PAGE法初步探究水蛭生品及其炮制品的蛋白差異利用SDS-PAGE凝膠電泳技術對水蛭生品及其炮制品的蛋白差異進行初步分析。2.4.2Label free法蛋白組學分析使用蛋白裂解液對蛋白進行提取,通過BCA法對提取的蛋白進行定量分析,對質量達標的蛋白進行還原烷基化處理,隨后進行Trypsin酶解,對Trypsin酶解得到的肽段進行液相串聯(lián)質譜分析。依據Label free技術將質譜采集到的數據在水蛭蛋白數據庫中進行搜索和匹配。分析水蛭生品及其炮制品的蛋白差異。2.5水蛭生品及其炮制品飲片表面真菌的培養(yǎng)與鑒定用無菌水沖洗水蛭生品及其炮制品飲片表面的真菌,采用平板法培養(yǎng)真菌。將得到的真菌進行分離、純化。結合真菌菌落形態(tài)、顯微結構、DNA條形碼技術共同鑒定水蛭飲片表面真菌種類。統(tǒng)計水蛭生品及其炮制品藥材表面真菌數目及種類,找出主要污染菌。2.6基于Illumina HiSeq 2500測序平臺分析水蛭表面真菌多樣性對水蛭生品及其炮制品表面真菌DNA進行提取,以ITS1序列為引物,進行PCR擴增。對PCR產物進行純化,質檢合格的樣品用Illumina HiSeq 2500進行測序。測序得到的原始序列,經過堿基識別,形成原始的測序序列,得到雙端Reads(PE reads),拼接雙端reads得到原始序列數(Raw Tags),原始序列過濾、去除嵌合體后得到有效序列數(Effective Tags)。使用質控過后的有效序列(Effective Tags)劃分操作分類單元,進行物種注釋。獲得各樣品在界、門、綱、目、科、屬、種分類學水平上的群落結構組成,分析水蛭飲片表面真菌種類的多樣性。3研究結果3.1水蛭抗凝血活性檢測通過2015版《中國藥典》規(guī)定的滴定法檢測發(fā)現(xiàn)水蛭生品及其炮制品抗凝血活性滿足藥典規(guī)定的3.0U。水蛭生品與炮制品對活化部分凝血酶時間(APTT)、凝血酶時間(TT)有顯著的延長作用,對凝血酶原(PT)時間影響較小。結合滴定法和體外檢測結果發(fā)現(xiàn)水蛭生品抗凝血活性最好,酒炙品次之,滑石粉燙制品的抗凝血活性最弱。3.2水蛭生品及其炮制品蛋白差異分析SDS-PAGE凝膠電泳結果顯示,蛋白裂解液提取的蛋白條帶個數最多且較為清晰。水蛭生品與炮制品在蛋白質的條帶顏色和數量上均存在較為明顯的差異,生品較為清晰的條帶個數約有11條,顏色較深。酒炙品較為清晰的條帶約有7個,顏色較淺�；蹱C制品較為清晰的條帶個數約有5-7個。表明水蛭在炮制過程中蛋白發(fā)生了降解。水蛭酒炙品與水蛭生品搜庫得到的蛋白質相比較,差異蛋白質中增加的為6個,下降的為72個。水蛭滑石粉燙制品與水蛭生品搜庫得到的蛋白質相比較,差異蛋白質中增加的為6個,下降的為192個。表明生品與酒炙品的蛋白表達更為接近。3.3水蛭生品及其炮制品表面真菌污染情況及多樣性分析對水蛭生品表面真菌進行培養(yǎng)共得到12種真菌,數量無法計數。對水蛭酒炙品表面真菌進行培養(yǎng)共得到15種,154株真菌。對水蛭滑石粉燙制品表面真菌進行培養(yǎng)共得到18種,107株真菌。水蛭表面真菌以曲霉屬、青霉屬、鏈格孢屬、枝孢屬為主。高通量測序結果顯示,水蛭表面真菌多樣性酒炙品滑石粉燙制品生品。真菌種類與平板法結果相似。4結論4.1綜合滴定法以及體外抗凝血活性研究發(fā)現(xiàn)水蛭抗凝血活性水蛭生品優(yōu)于炮制品,酒制品的抗凝血活性略高于滑石粉燙制品。4.2綜合SDS-PAGE與Label free結果,水蛭生品經過炮制后蛋白含量減少,但是炮制品仍有抗凝血活性,表明水蛭生品炮制過中大分子蛋白質變成具有抗凝血活性的小分子蛋白或肽段。4.3綜合平板法及高通量測序結果,水蛭炮制品表面真菌種類多于生品,水蛭表面真菌主要來自青霉屬和曲霉屬。5創(chuàng)新點5.1首次利用Label free技術對水蛭生品及其炮制品的蛋白組學進行研究,從蛋白層面分析水蛭生品與炮制品的藥效差異。5.2首次利用Illumina Hiseq平臺對水蛭生品及其炮制品表面真菌進行高通量測序,并對其表面多樣性進行評估。
【學位授予單位】：北京中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R283
【圖文】：

圖１實驗流程圖逡逑

圖２－１水蛭生品及其炮制品抗凝血酶效價柱狀圖逡逑水蛭生品及其炮制品的凝血酶滴定結果顯示，水蛭生品、酒炙品、滑石粉燙制血活性的均值分別為４．６７邋Ｕ、３．５４邋Ｕ、３．２９邋Ｕ，符合藥典規(guī)定。生品的抗凝血活于酒炙品和滑石粉燙制品。利用ＳＡＳ軟件對方差進行分析，結果顯示水蛭生品、逡逑

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本文編號：2714571