【摘要】：目的:利用生物信息學技術,使用數(shù)據(jù)庫結(jié)合軟件快速對本課題組前期經(jīng)過ITRAQ篩選出的何首烏相關差異蛋白進行基于本體論注釋的聚類分析,蛋白質(zhì)相互作用分析,同時使用經(jīng)內(nèi)毒素脂多糖(lipopolysaccharide,LPS)誘導的大鼠肝損傷炎癥模型,研究何首烏對該模型的肝損傷作用,并進一步檢測膽汁淤積相關指標,從而為闡明何首烏肝毒性機制提供線索,為后續(xù)實驗奠定理論基礎。方法:對差異蛋白進行GO聚類分析、蛋白質(zhì)互作分析、KEGG通路分析與Meta Core蛋白互作網(wǎng)絡富集分析。然后將136只體重為180-200 g的雄性SD大鼠分為以下5組:空白對照組(Ctrl)、LPS組(LPS)、LPS+對乙酰氨基酚(LPS+APAP)、何首烏組(AEP)和LPS+何首烏組(LPS+AEP)。并按動物體重,尾靜脈注射給予LPS組、LPS+AEP組4 mg/kg LPS。2 h后灌胃給予AEP組和LPS+AEP組12 g/kg(相當于臨床給藥劑量22倍)何首烏,每日一次,連續(xù)給藥7天建立特異質(zhì)肝損傷炎癥模型。觀察體重變化,進行肝臟系數(shù)及組織病理學檢查,并分別取第2 h、14 h、5 d、8 d四個時間點檢測血生化肝功能相關指標同時收集膽汁,計算膽汁流速與密度并檢測膽汁中主要成分變化。對膽汁淤積相關蛋白膽鹽輸出泵轉(zhuǎn)運蛋白(BSEP)、多藥耐藥蛋白2(MRP2)及多藥耐藥蛋白3(MRP3)進行Real-Time PCR檢測。結(jié)果:1.通過ITRAQ技術篩選找出17β-羥基固醇類脫氫酶2、碳酸酐酶同工酶、重組人蛋白酪氨酸磷酸酯酶非受體1型、細胞色素P450 2B1(CYP2B1)、60S核糖體蛋白L13、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶2、線粒體ATP合成酶復合體亞基C1、超氧化物歧化酶2(SOD2)等36種蛋白質(zhì)作為潛在LPS激活何首烏肝損傷的生物標志物,為何首烏肝毒性研究提供檢測和預防的檢查手段。進一步對這些蛋白進行蛋白網(wǎng)絡互作分析,發(fā)現(xiàn)一些重要蛋白:尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2b17(UGT2B17)、CYP2B13、CYP2C6、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶2、17β-羥基固醇類脫氫酶2、60S核糖體蛋白L10、40S核糖體蛋白S23、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽還原酶、烯脂酰-Co A還原酶、酰基輔酶A硫酯酶5、鋅轉(zhuǎn)運蛋白10、鋅轉(zhuǎn)運蛋白、線粒體導入受體亞基TOM6同族體、線粒體ATP合成酶復合體亞基C1。2.在差異蛋白的GO中,與細胞組成相關的有156條,與分子功能相關的有98條,與生物過程相關的有321條。3.經(jīng)過KEGG pathway分析,發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白主要參與甾類激素生物合成途徑、核糖體途徑、化學致癌途徑、視黃醇代謝途徑、原發(fā)性免疫缺陷途徑等。4.通過Meta Core對網(wǎng)絡分布進行富集分析,我們發(fā)現(xiàn)差異蛋白主要參與炎癥系統(tǒng)如IL2、IL6信號傳導通路、免疫相關信號如MHC家族相關的抗原呈遞途徑、抗原呈遞的吞噬小體信號通路、膽汁酸代謝調(diào)節(jié)、線粒體細胞凋亡、DNA損傷修復等途徑。5.成功建立的經(jīng)LPS誘導的何首烏肝損傷SD大鼠模型;6.經(jīng)過LPS誘導2 h后LPS+AEP組與空白對照組、AEP組相比體重明顯下降,至8 d肝臟系數(shù)顯著增加(P0.05)。血清生化指標顯示,LPS+AEP組ALT,AST水平無明顯變化。8 d的TBIL明顯降低(P0.05)而ALP升高(P0.05),LPS+AEP組可觀察到膽汁密度和膽汁流速明顯降低。對膽汁成分分析顯示TCHO升高,TBIL顯著降低(P0.05)。病理結(jié)果顯示AEP組出現(xiàn)輕微肝細胞變性,而LPS+AEP組可見嚴重局灶壞死。轉(zhuǎn)錄水平結(jié)果發(fā)現(xiàn)LPS誘導后可使得BSEP、MRP2在14 h時出現(xiàn)短期抑制(P0.05),單獨給予AEP可使BSEP、MRP2和MRP3的表達水平顯著升高(P0.05,P0.01)。而LPS+AEP給藥第8 d對大鼠肝臟BSEP、MRP2無顯著性影響,但可使MRP3轉(zhuǎn)錄水平升高(P0.05)。結(jié)論:1.通過分析差異蛋白的GO注釋,發(fā)現(xiàn)這些蛋白主要代謝、免疫、應激反應、細胞殺傷等方面來影響機體功能。2.通過蛋白質(zhì)互作分析發(fā)現(xiàn)了一些可能與肝毒性機制相關的差異蛋白,分別是尿苷二磷酸葡萄糖醛酸轉(zhuǎn)移酶2b17(UGT2B17)、CYP2B13、CYP2C6、雌激素硫酸轉(zhuǎn)移酶2、17β-羥基固醇類脫氫酶2、60S核糖體蛋白L10、40S核糖體蛋白S23、超氧化物歧化酶2、谷胱甘肽還原酶、烯脂酰-Co A還原酶、�；o酶A硫酯酶5、鋅轉(zhuǎn)運蛋白10、鋅轉(zhuǎn)運蛋白、線粒體導入受體亞基TOM6同族體、線粒體ATP合成酶復合體亞基C1。根據(jù)分析結(jié)果推測可能與膽紅素代謝相關。3.通過KEGG pathway分析發(fā)現(xiàn)這些差異蛋白參與的主要代謝途徑有:甾類激素生物合成途徑、核糖體途徑、化學致癌途徑、視黃醇代謝途徑、原發(fā)性免疫缺陷途徑。4.通過Meta Core對網(wǎng)絡分布進行富集分析,我們發(fā)現(xiàn)除了與炎癥系統(tǒng)如IL2、IL6信號傳導通路、免疫相關信號如MHC家族相關的抗原呈遞途徑、抗原呈遞的吞噬小體信號關聯(lián)較大以外,還與膽汁酸代謝調(diào)節(jié)有關。5.經(jīng)LPS誘導的何首烏醇提液可明顯損傷大鼠肝細胞并干擾膽汁分泌功能,改變大鼠膽汁成分引起相關生化指標的改變。BSEP與MRP2水平無顯著影響,而MRP3水平出現(xiàn)代償性升高,提示確實存在膽汁淤積癥狀,但可能存在其他機制。
【圖文】：

廣東藥科大學碩士研究生畢業(yè)論文ABCB11），是膽汁鹽依賴性小管膽汁分泌的主要決定因素[59]和多藥耐藥蛋白-2（MRP2，ABCC2）通過谷胱甘肽的排泄確定膽汁鹽獨立膽汁流[57]。 MRP2 還將藥物綴合物和二價膽汁鹽綴合物輸送到膽汁中。其他 ATP 依賴性轉(zhuǎn)運蛋白包括運輸有機陽離子（叔胺或季胺）的多藥耐藥蛋白（MDR1，ABCB1），運輸有機陰離子（包括藥物偶聯(lián)物）的乳腺癌耐藥蛋白（BCRP，ABCG2）和多藥耐藥蛋白 3（MDR3，，ABCB4），磷脂翻轉(zhuǎn)酶。

圖 2.iTRAQ 技術流程2 實驗方法2.2.1 蛋白篩選方法旨在采用不同的篩選方法以篩選出肝損傷機制可能相關蛋白。（1）采用第 8 天 LPS+AEP 組蛋白與空白對照組差異蛋白進行篩選第14小時LPS對肝損傷影響較大而何首烏無明顯影響，因此采用第8天LPS+蛋白與空白對照組差異蛋白（8d-G4/8d-G1）進行篩選。（2）排除 LPS 影響因 LPS 本身會導致急性肝損傷，而第 5 天之后 LPS 組的大鼠體重明顯恢復， LPS 影響逐漸減弱，但第 8 天 LPS+AEP 組與空白對照組（8d-G2/8d-G1）不能完除其影響，因此需要排除 LPS 影響。（4）第 8 天 AEP 組與空白對照組（8d-G3/8d-G1）差異蛋白
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2711870