發(fā)布時間：2020-06-13 12:26

【摘要】：實驗?zāi)康?甲型流感病毒是一種具有高度傳染性的人畜共患病原體,并能引起嚴重的呼吸系統(tǒng)感染疾病,甚至死亡。由于流感病毒變異速度迅速,耐藥株出現(xiàn)頻率高,故目前尚缺乏理想的抗病毒西藥和疫苗,而作為來源廣泛,毒副作用小且多靶點天然中藥產(chǎn)物,具有良好的抗病毒作用,成為近年來醫(yī)學(xué)研究的熱點。表告依春是從中藥板藍根中分離出來的一種生物堿類化合物,研究發(fā)現(xiàn)表告依春體外具有一定的抗病毒、抗氧化、抗炎的作用,且體內(nèi)生物利用度良好,但其體內(nèi)藥效作用和機制仍未闡明。因此,本課題采用了應(yīng)激負荷的流感“易感”小鼠模型對表告依春抗流感的體內(nèi)藥效進行了有效評價,并采用CORT負荷A549細胞模型對其作用機制進行深入研究,旨為表告依春的臨床應(yīng)用和開發(fā)提供有益的理論和實驗依據(jù),并進一步闡明傳統(tǒng)中醫(yī)藥在抗病毒作用機理。實驗方法:本論文探究了表告依春對應(yīng)激負荷小鼠感染流感病毒易感性的影響。動物實驗研究方案如下,KM小鼠隨機分成6組,包括正常對照組(Normal)、病毒感染組(Virus)、應(yīng)激負荷+病毒組(Stress+Virus)、奧司他韋組(Oseltamivir+Stress+Virus)、表告依春低劑量組(Epigoitrin-L+Stress+Virus)、表告依春高劑量組(Epigoitrin-H+Stress+Virus)。其中,奧司他韋組、表告依春低濃度組、表告依春高濃度組的給藥劑量分別為30 mg/kg/day、2.5mg/kg/day、5 mg/kg/day。各給藥組的小鼠連續(xù)7天灌服對應(yīng)劑量的藥物,其他組則灌服等量的0.9%氯化鈉溶液。給藥的當(dāng)天,各組小鼠被施加應(yīng)激拘束負荷,持續(xù)時間為22 h(正常對照組、病毒感染組除外),在此期間所有小鼠禁水禁食。拘束完成后第2天,將各組小鼠置于乙醚麻醉,正常對照組除外,每只小鼠給予35μL的PBS病毒懸液(2×LD_(50))感染流感病毒。接下來連續(xù)觀察21天,觀察小鼠發(fā)病、死亡的相關(guān)情況,并每日進行記錄。其中,若小鼠出現(xiàn)如食欲下降、弓背、呼吸改變、褶毛、運動遲緩、感知變?nèi)醯攘鞲斜碚鲿r即為發(fā)病。對上述記錄觀察進行統(tǒng)計分析。其次,研究表告依春對應(yīng)激負荷小鼠感染流感病毒繼發(fā)性肺炎的影響并探討表告依春抗流感病毒降低病毒易感性的機制研究。具體實驗方法如下,(1)將已適應(yīng)性飼養(yǎng)的另一批實驗小鼠隨機分為六個組別,即應(yīng)激負荷+病毒組(Stress+Virus)、奧司他韋組(Oseltamivir+Stress+Virus)、表告依春低劑量組(Epigoitrin-L+Stress+Virus)、表告依春高劑量組(Epigoitrin-H+Stress+Virus)、正常對照組(Normal)、病毒感染組(Virus)。各組小鼠給藥、給予拘束應(yīng)激負荷和感染流感病毒等處理一致,感染病毒第五天,稱重并記錄,后乙醚麻醉處死,收集小鼠肺臟組織用分析天平秤重、肉眼觀察、相機拍照。取部分肺組織固定后進行HE染色、拍片,取部分肺組織進行蛋白裂解后,利用western blotting檢測各組炎癥因子白介素1-β(IL1-β)、腫瘤壞死因子(TNF-α)的蛋白表達。(2)實驗分組及處理如上所示,小鼠感染流感病毒后第5天,處死,收集小鼠肺組織,用Western blotting檢查肺臟組織中的IFN-β、IFITM3、Mfn2、MAVS的蛋白表達水平。最后,采用CORT負荷A549細胞模型驗證表告依春的抗病毒作用機制。用MTT法篩選出表告依春在CORT負荷A549細胞適合的給藥量。為驗證表告依春對CORT負荷A549細胞感染流感病毒的影響,根據(jù)實驗需要,將細胞隨機分為以下六組,分別為正常對照組(Normal)、病毒感染組(Virus)、皮質(zhì)酮組(CORT)、模型組(CORT+Virus)、表告依春+病毒組(Epigoitrin+Virus)、表告依春模型組(Epigoitrin+CORT+Virus)。表告依春預(yù)保護細胞2 h,隨后100μM CORT負荷2天,PBS洗3遍后,以10 TCID_(50)流感病毒稀釋液浸染對應(yīng)組別的A549細胞1 h,洗去病毒稀釋液后再培養(yǎng)8 h。收集細胞,檢測NP、Mfn2、MAVS、IFITM3、p-IRF3、NF-κB的基因或蛋白表達水平。實驗結(jié)果:(1)研究結(jié)果顯示,表告依春能提高應(yīng)激負荷小鼠的生存率和健康率,降低應(yīng)激負荷小鼠感染H1N1流感病毒后的死亡率、發(fā)病率,提示表告依春對H1N1流感病毒感染的應(yīng)激負荷小鼠有良好的保護作用。(2)通過對小鼠肺臟組織重量、外觀、HE染色切片、檢測肺部組織蛋白水平表達等觀察表明,表告依春能夠降低感染H1N1應(yīng)激負荷小鼠的肺指數(shù),降低由流感病毒誘發(fā)的肺水腫程度及肺臟組織損傷水平,下調(diào)肺組織中炎癥因子IL1-β、TNF-α的蛋白分泌水平表達,使病變組織炎癥減輕,起到了改善繼發(fā)性肺炎的作用。(3)表告依春能夠上調(diào)感染流感病毒的拘束應(yīng)激負荷小鼠肺組織中的MAVS蛋白水平,下調(diào)Mfn2水平,增加IFN-β及IFITM3水平表達,促進干擾素效應(yīng),表明表告依春通過調(diào)節(jié)MAVS信號通路的相關(guān)蛋白表達水平從而發(fā)揮降低H1N1易感性的作用。(4)在CORT負荷的A549細胞模型中,表告依春能夠減少NP的表達水平,進一步研究發(fā)現(xiàn),表告依春能增加MAVS表達,下調(diào)Mfn2表達,促進IRF-3磷酸化,下調(diào)NF-κB,增加IFITM3蛋白表達。研究結(jié)論:表告依春能通過降低感染病毒小鼠肺部組織中炎癥因子的表達,明顯改善繼發(fā)性肺炎的癥狀,降低病毒感染易感小鼠的發(fā)病率,從而提高小鼠生存率。這與其介導(dǎo)線粒體融合蛋白Mfn2增強MAVS固有免疫信號通路的響應(yīng)密切相關(guān)。表告依春能通過Mfn2-MAVS信號通路發(fā)揮抗病毒作用,改善拘束應(yīng)激引起的流感易感性。
【圖文】：

活性成分——表告依春的抗流感病毒作用。研究結(jié)果表明激負荷小鼠及 CORT 細胞流感病毒易感性。顯示，在拘束應(yīng)激小鼠模型中，表告依春能夠延長小鼠病毒的發(fā)病率及死亡率；HE 染色表明表告依春同時能明肺損傷，降低炎癥因子如 TNF- 、IL-1β 的產(chǎn)生從而降低研究發(fā)現(xiàn)，Mfn2 作為線粒體融合蛋白 2，，與流感病毒易夠通過抑制 MAVS 聚集從而削弱固有免疫反應(yīng)響應(yīng)程度告依春的作用機制后，我們發(fā)現(xiàn)在體內(nèi)和細胞模型中（如依春組均能明顯降低 Mfn2 的表達，促進 MAVS 蛋白水 抗病毒通路作用中的信號傳導(dǎo)，進一步使干擾素分泌增的清除；同時表告依春也會使 MAVS 通路激活 IKKε 使促炎因子的分泌，降低疾病易感性。
【學(xué)位授予單位】：暨南大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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1 段林建;孫堅;何士勤;;中藥治療甲型流感作用機制的研究進展[J];中國全科醫(yī)學(xué);2012年10期

2 阿麗塔;許培揚;田玲;張玢;劉曉婷;;基于文獻的1918年西班牙流感中國疫情分析[J];醫(yī)學(xué)信息學(xué)雜志;2010年01期

3 陳智偉;吳靈威;劉樹滔;蔡春平;饒平凡;柯李晶;;毛細管電泳法研究板藍根水提物抗流感病毒的作用機制[J];中國中藥雜志;2006年20期

4 徐麗華,黃芳,陳婷,吳潔;板藍根中的抗病毒活性成分[J];中國天然藥物;2005年06期

5 李文旭;流行性感冒的中醫(yī)學(xué)認識與臨床[J];中醫(yī)研究;1996年02期

本文編號：2711179