【摘要】：紅景天為景天科紅景天屬多年生草本植物,或亞灌木野生植物,其種類繁多,是具有悠久歷史的珍貴傳統(tǒng)藥材,入藥主要部位是干燥根或根莖。紅景天的藥理作用主要有抗缺氧、抗疲勞、抗衰老、抗輻射和抗病毒等,已作為具有明顯抗缺氧作用的中藥而廣泛應(yīng)用于臨床。紅景天的化學(xué)成分復(fù)雜,主要包括酚苷類、黃酮類、香豆素類和氨基酸類等,其中酚苷類的紅景天苷和黃酮類成分中的紅景天素和草質(zhì)素苷是主要活性成分。在定量測定和藥代動力學(xué)研究方面,紅景天苷作為紅景天的主要成分研究得最多,紅景天素和草質(zhì)素苷也有一些研究,測定方法有高效液相色譜法(high performance liquid chromatography,HPLC)、液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(liquid chromatography-tandem mass spectrometry,LC-MS/MS)法和超高效液相色譜質(zhì)譜聯(lián)用(ultra-performance liquid chromatography tandem mass spectrometry,UPLC-MS/MS)法等。但采用UPLC-MS/MS同時測定血漿中的紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷及其藥動學(xué)未見報道,缺氧條件下其活性主成分的藥代動力學(xué)更未見報道。本研究首先應(yīng)用UPLC-MS/MS建立了紅景天6個活性成分紅景天苷和黃酮類化合物(紅景天素、草質(zhì)素苷、草質(zhì)素、槲皮素、山柰酚)的定量測定方法,為后續(xù)紅景天活性成分的藥代動力學(xué)和抗缺氧的研究奠定基礎(chǔ)。接著選取紅景天主要活性成分紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷作為受試藥,建立了同步測定這三種成分的體內(nèi)UPLC-MS/MS定量方法,比較研究了在缺氧和常氧條件下這三種成分的藥代動力學(xué)特征。結(jié)果為紅景天活性成分的結(jié)構(gòu)和新制劑改進及低氧臨床用藥提供了堅實的實驗依據(jù)。本論文的研究內(nèi)容主要包括以下幾個部分:1.紅景天主要活性成分的含量測定建立了快速、靈敏度高和專屬性好的UPLC-MS/MS的方法,對紅景天提取物中的標(biāo)示成分酚苷類成分(紅景天苷)和黃酮類成分(紅景天素、草質(zhì)素苷、草質(zhì)素、槲皮素和山柰酚)進行了含量測定。液相條件:流動相為乙腈和0.2%甲酸水,梯度洗脫,流速為0.4 ml/min,分析過程7 min。質(zhì)譜條件:電噴霧離子化源(electrospray ionization,ESI),多重反應(yīng)監(jiān)測模式(multiple reaction monitoring,MRM)定量掃描。離子反應(yīng)分別為:m/z 345.0→299.0(紅景天苷)、m/z 609.1→301.0(紅景天素)、m/z 447.1→301.0(草質(zhì)素苷)、m/z 301.0→254.8(草質(zhì)素)、m/z 284.8→92.9(山柰酚)和m/z 301.1→151.1(槲皮素)。驗證了方法學(xué)的精密度、穩(wěn)定性、重復(fù)性和加樣回收率,均符合測定要求。對三個批次的紅景天提取物進行了測定。結(jié)果表明,紅景天苷的含量最高,為1.11%。黃酮類化合物中紅景天素和草質(zhì)素苷的含量比較高,分別為0.41%和0.32%。由于紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷的含量相對較高,且具有明顯的藥理活性,因此,選擇這三種成分進行藥動學(xué)特征研究。2.紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷體內(nèi)分析方法的建立與驗證首次建立了同時測定紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷的UPLC-MS/MS大鼠血漿藥物濃度測定方法。選用葛根素為內(nèi)標(biāo),反應(yīng)離子:m/z 417.3→297.1。結(jié)果表明,三種成分和內(nèi)標(biāo)的峰型和分離度良好,且內(nèi)源性物質(zhì)不干擾測定。血漿中紅景天苷的線性范圍為5-2500 ng/ml,紅景天素為10-2000 ng/ml,草質(zhì)素苷10-1000 ng/ml。定量下限(lower limit of qualification,LLOQ)分別為5ng/ml,10 ng/ml及10 ng/ml。三種成分的低、中、高3個濃度的質(zhì)控(quality control,QC)樣品的提取回收率在63.8-98.6%之間。紅景天苷的日內(nèi)與日間精密度小于10.4%,準(zhǔn)確度在91.8-100.0%之間。紅景天素的日內(nèi)與日間精密度小于8.05%,準(zhǔn)確度在89.5-97.6%之間。草質(zhì)素苷的日內(nèi)與日間精密度小于8.69%,準(zhǔn)確度在83.8-87.8%之間。選擇三個條件(進樣器存在4 h,-20℃冷凍-溶解三次,-80℃存放7天)進行穩(wěn)定性驗證,紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷的準(zhǔn)確度范圍分別為88.3 109%,76.6 99.6%和75.6 98.6%。黃酮苷類化合物紅景天素和草質(zhì)素苷的提取回收率比紅景天苷要低。酸化可提高黃酮苷類在血漿樣品中的穩(wěn)定性。3.低氧對紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷藥代動力學(xué)特征的影響20只Sprague Dawley(SD)大鼠隨機分為四組,即常氧口服組,常氧靜脈組,缺氧口服組和缺氧靜脈組,每組5只。常氧組大鼠暴露于常氧條件下,缺氧組大鼠在低氧艙內(nèi)暴露3d后給藥,低氧艙內(nèi)氧氣濃度控制在(9.0±0.5)%。紅景天提取物的給藥劑量為,口服組400 mg/kg(其中:紅景天苷4.44 mg/kg,紅景天素1.64 mg/kg,草質(zhì)素苷1.28 mg/kg),靜脈組40 mg/kg(其中紅景天苷0.444 mg/kg,紅景天素0.164 mg/kg,草質(zhì)素苷0.128 mg/kg)。UPLC-MS/MS測定血漿藥物濃度。采用DAS軟件計算主要藥代動力學(xué)參數(shù),采用SPSS 17.0統(tǒng)計軟件進行統(tǒng)計學(xué)分析處理。結(jié)果表明,在缺氧條件下,紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷的藥代動力學(xué)特征發(fā)生顯著變化。缺氧暴露后,紅景天苷的藥-時曲線下面積(area under the curve,AUC)明顯升高(p0.05),平均駐留時間(mean retention time,MRT)和半衰期(half life,t1/2)明顯延長(p0.001和p0.05),表明缺氧導(dǎo)致紅景天苷的體存量增加,體內(nèi)存留時間延長,藥物消除變慢。其達峰濃度(maximum concentration,Cmax)和達峰時間(time of peak concentration,tmax)沒有發(fā)生顯著性變化,提示其吸收過程相似。常氧條件下,口服后所測得的紅景天素和草質(zhì)素苷的藥物濃度低于定量下限(可能是由于自己所建方法的定量下限過高),但在缺氧條件下能得到各自較完整的藥-時曲線。缺氧靜脈給藥后,紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷的AUC都顯著升高(p0.05),其清除率(clearance,CL)均明顯變小(p0.05)。此外,紅景天素的MRT和t1/2都明顯延長(p0.01),草質(zhì)素苷的t1/2也延長(p0.05),提示缺氧可以增加紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷的體存量,延長體內(nèi)存留時間,使消除減慢。總之,缺氧可以影響紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷在大鼠體內(nèi)的代謝動力學(xué)過程,進而影響藥物的治療結(jié)果和毒性。臨床給藥需要相應(yīng)調(diào)整劑量。4.紅景天提取物口服(5倍劑量)常氧條件下的藥代動力學(xué)研究研究常氧條件下口服給紅景天提取物后,紅景天素和草質(zhì)素苷在大鼠血漿中未檢測到的原因。將紅景天提取物口服劑量提高5倍,用UPLC-MS/MS測定大鼠血漿中紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷含量。結(jié)果表明,給藥劑量提高5倍后,紅景天苷顯示出雙峰的藥-時曲線,推測可能存在肝腸循環(huán)。紅景天素和草質(zhì)素苷也能可得到較完整的藥-時曲線,但Cmax的水平都較低,體內(nèi)暴露量較低,生物利用度分別只有0.98%和1.47%。紅景天素和草質(zhì)素苷較低的生物利用度導(dǎo)致在給藥劑量較低的情況下進入血液循環(huán)的藥物量更少,低于定量限而不能檢測到原型藥物。本研究為紅景天提取物及其主要成分紅景天苷、紅景天素和草質(zhì)素苷在低氧環(huán)境下的給藥方案的調(diào)整和優(yōu)化提供了堅實的實驗依據(jù)。
【圖文】：

F G圖3.紅景天提取物總離子流色譜圖及各成分多反應(yīng)監(jiān)測模式下的色譜圖Fig. 3. TIC and MRM chromatograms of the ingredients in Rhodiola extractA-紅景天提取物總離子流色譜圖 B-紅景天苷 C-紅景天素 D-草質(zhì)素苷E-草質(zhì)素 F-山柰酚 G-槲皮素A- TIC of Rhodiola extract B- Salidroside C- Rhodiosin D- RhodioninE- Herbacetin F- Kaempferol G- Quercetin
【學(xué)位授予單位】：首都醫(yī)科大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R284;R285.5

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本文編號：2710324