【摘要】：研究背景:近年來,關于服用含何首烏制劑后出現(xiàn)藥物性肝損傷的報道增多,也引起了部分藥學領域?qū)＜业牡年P注,據(jù)文獻報道,關于何首烏毒性的動物試驗研究發(fā)現(xiàn),何首烏毒性反應與臨床報道不同,因此,有關肝病專家考慮服用含何首烏制劑出現(xiàn)藥物性肝損傷,其根本原因在于個體差異。因其發(fā)病率低,不易被檢測到,且與藥物使用劑量無明顯聯(lián)系,考慮含何首烏制劑致藥物性肝損傷類型屬于特異質(zhì)肝損傷型。關于特異質(zhì)肝損傷發(fā)生機制,目前主要有兩方面假說,一類是化學藥物誘導的特異質(zhì)肝損傷免疫學機制假說,包括免疫藥理(p-i)假說、基因多態(tài)性假說、半抗原假說等,一類是中藥免疫應激“三因致毒”假說。中藥免疫應激“三因致毒”假說重點在于中藥“無毒”理論,有研究通過構建低劑量LPS模型,證明何首烏的特異質(zhì)肝損傷屬性,并且發(fā)現(xiàn)何首烏誘導的特異質(zhì)肝損傷是機體免疫功能異常、何首烏中免疫活性成分(反式二苯乙烯苷,trans-SG)、潛在肝損傷易感成分(順式二苯乙烯苷,cis-SG)三者協(xié)同作用的結果,而在三者中,機體免疫功能異常是導致肝損傷的基礎,因此本研究落腳于獲得機體免疫特征。研究目的:通過分析服用含何首烏制劑后出現(xiàn)肝損傷與未出現(xiàn)肝損傷患者外周血TCR免疫組庫特征,發(fā)現(xiàn)服用含何首烏制劑易出現(xiàn)肝損傷患者的免疫組庫特征,為篩選對何首烏致肝損傷的高敏人群,降低服用含何首烏制劑后出現(xiàn)不良反應發(fā)生提供參考。資料與方法:1、本研究基于“重大新藥創(chuàng)制”國家科技重大專項課題參與單位收集的服用何首烏及其制劑后出現(xiàn)藥物性肝損傷患者,填寫數(shù)據(jù)采集表并采集血樣。使用巢式病例對照方法,對納入服用含何首烏制劑出現(xiàn)肝損傷患者年齡±5歲,性別相同,基礎疾病相近,口服主要成分包括何首烏的制劑且沒有表現(xiàn)出肝臟受損的病患,使用1:1的比例進行匹配。共納入患者92例。在數(shù)據(jù)采集過程中主要應用巢式病例對照設計:巢式病例對照設計結合了隊列研究與對照設計的優(yōu)勢,在臨床試驗中常用于罕見病研究,藥物性肝損傷是小概率發(fā)生事件,因此本試驗可應用此方法;樣品檢測應用免疫組庫測序方法:免疫組庫是在特定時間內(nèi),人體免疫系統(tǒng)中T細胞或B細胞的總和,研究免疫組庫特征就需要測定免疫系統(tǒng)中TCR序列及基因信息,本方法通過PCR擴增技術,獲得T細胞多樣性的互補決定區(qū),再通過第二代高通量測序技術,在宏觀上評估免疫系統(tǒng)的多樣性,深入挖掘免疫組庫與特異質(zhì)肝損傷發(fā)生的關系。樣品檢測由華大基因公司進行,主要包括淋巴細胞提取、文庫的構建、文庫的質(zhì)量檢測以及測序,樣品檢測主要檢測樣品濃度和完整性,熒光定量主要對樣品濃度進行精確定量,瓊脂糖凝膠電泳使用1%濃度的瓊脂糖凝膠在150V電壓下電泳約40min,主要是檢測樣品完整性。,文庫構建選用QIAGEN試劑盒進行多重PCR反應,使用Agilent 2100 Bioanalyzer技術檢測文庫的片段范圍,并使用ABI Step One Plus Real-Time PCR System(TaqMan Probe)技術對文庫進行濃度的定量。檢測合格的文庫,加入NaOH變性成單鏈,按照預期上機密度,將變性稀釋后的文庫加入到FlowCell內(nèi),和FlowCell上的接頭相互接觸,再通過簇生成平臺cBot完成橋式PCR擴充,然后在IlluminaHiSeq2000平臺上完成測序。應用VDJtools軟件做比對后的分析,基本統(tǒng)計分析、克隆多樣性評估、樣本間克隆重疊,樣本間克隆群體相似度等分析模塊結果:1、一般資料結果:共納入患者92例,男女比例為1:1,所有患者的年齡均在38-85歲之間,平均年齡是64.45歲,中位數(shù)是63歲。對所有患者涉及的基礎疾病進行統(tǒng)計,觀察組按出現(xiàn)頻次排前5位的分別是高血壓、冠心病、高血脂、糖尿病及腔隙性腦梗塞;對照組患者按出現(xiàn)頻次排前5位的分別是高血壓、冠心病、心律失常、2型糖尿病和腔隙性腦梗死;對納入患者服用含何首烏制劑治療的疾病進行統(tǒng)計,觀察組患者服用含何首烏制劑治療的疾病按頻次排前3位的是冠心病,高血壓和高血脂,對照組患者服用含何首烏制劑治療的疾病按頻次排前3位的是冠心病、高血壓和心律失常;對使用含何首烏制劑中何首烏類型進行統(tǒng)計,其中其中懷疑用藥制首烏為86例,均為中成藥;不明首烏類型為6例,均為中藥湯劑。2、免疫組庫結果(1)觀察組在CDR3數(shù)量及克隆種類上明顯高于對照組,且有統(tǒng)計學差異。而測序深度差別不大;(2)分析所CDR3區(qū)氨基酸序列長度,發(fā)現(xiàn)長度為17,20,46,62,63處存在統(tǒng)計學差異;(3)分析V基因豐度,發(fā)現(xiàn)TRBV13,TRBV29,TRBV5-5,TRBV6-8豐度在兩組間存在統(tǒng)計學差異;(4)分析J基因豐度,發(fā)現(xiàn)TRBJ2-4,TRBJ2-5豐度在兩組間存在統(tǒng)計學差異;(5)分析兩組之間同一對v-j基因組合統(tǒng)計學差異,TRBV13,TRBV29,TRBV5-5,TRBV6-8與TRBJ2-4,TRBJ2-5基因重組存在差異;(6)通過 clone number,resampled diversity,extrapolate_diversity,chaoE,chaol,shannon Wiener Index,inverse Simpson Index共7種指標反映樣本的多樣性結果,可以得出,除shannon Wiener Index和inverse Simpson Index外,其余各指標均顯示兩組觀察組多樣性高于對照組,且有統(tǒng)計學差異,其中,chaol指標更顯示有明顯統(tǒng)計學差異。結論:(1)觀察組CDR3序列多樣性高于對照組且存在統(tǒng)計學差異。提示特異質(zhì)肝臟受損的發(fā)病及惡化和免疫組庫的多樣性具有緊密聯(lián)系。(2)通過比較發(fā)現(xiàn)出現(xiàn)肝損傷患者外周血TCR CDR3免疫組庫中存在多對V-J基因重組有差異性,且差異主要體現(xiàn)在TRBJ2-4與TRBJ2-5基因上面,提示TRBJ2-4與TRBJ2-5重組異常影響抗原受體。
【圖文】：

圖１藥物性肝損傷診斷流程圖逡逑３、樣品采集、檢測及數(shù)據(jù)分析逡逑

圖２淋巴細胞分離示意圖逡逑
【學位授予單位】：中國中醫(yī)科學院
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.6

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本文編號：2709693