【摘要】：目的:通過觀察金線蓮多糖提取物(Anoectochilus roxburghii polysaccharides,ARP)對LO2細胞脂肪變性模型和非酒精性脂肪肝病(NAFLD)動物模型的影響,探討ARP對NAFLD的調脂保肝作用及其可能的作用機制,以期為該藥的進一步開發(fā)研究和臨床應用提供科學依據。方法:用含50%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)液誘導人肝LO2細胞,以建立肝細胞脂肪變性模型,油紅O染色,倒置顯微鏡觀察肝細胞中脂滴積聚情況并檢測細胞內甘油三酯(TG)水平。檢測ARP對LO2細胞的細胞毒作用,然后設正常組,模型組,ARP高、中、低劑組。藥物作用24 h后,檢測肝細胞內TG,細胞培養(yǎng)上清液肝酶(ALT、AST)及細胞氧化應激相關指標,包括超氧化物歧化酶(SOD),谷胱甘肽過氧化物酶(GSH-Px)和丙二醛(MDA)。取48只雌性SPF級(Sprague-Dawlay,SD)大鼠,按體質量隨機分為正常組,模型組,辛伐他汀組(8 mg/kg),ARP高、中、低劑量組(238、119、59.5 mg/kg)。早上正常組給予普通飼料喂養(yǎng)及等體積生理鹽水灌胃,其余各組均以1 m L/100 g灌服高脂乳劑復制大鼠NAFLD模型,下午正常組和模型組給予等體積生理鹽水灌胃,藥物組分別給予辛伐他汀及ARP高、中、低劑量灌胃,連續(xù)給藥8周。實驗期間每天記錄大鼠的生長狀況,每周定期稱重。實驗結束末,取血并及時摘除肝臟稱取肝濕重。肉眼觀察各組大鼠肝臟形態(tài)變化,光鏡下觀察病理形態(tài)變化并評分;測定各組血脂,血糖,肝功能,肝脂,超氧化物歧化酶(SOD),丙二醛(MDA)的含量;逆轉錄-聚合酶鏈反應法(Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction,RT-PCR)檢測CYP2E1基因的表達。結果:第一部分ARP對肝細胞脂肪變性模型的研究50%胎牛血清誘導LO2細胞24 h后,油紅O染色可見細胞內有大小不等的橘紅色脂滴存在,與正常組比較,模型組細胞內TG含量顯著增加(P0.01),表明NAFLD脂肪變性體外模型成功復制。ARP可改善脂肪變性LO2細胞內的脂質沉積、顯著降低細胞內TG含量(P0.01),顯著降低細胞上清液ALT、AST含量(P0.01),顯著升高細胞內SOD、GSH-Px(P0.01)活性。第二部分ARP對NAFLD大鼠實驗研究與正常組比較,模型組血清TG、TC、LDL-C、FFA、FBG、ALT、AST水平顯著升高(P0.05或0.01),血清HDL-C明顯降低(P0.05),肝指數及肝TC、TG、MDA含量均顯著升高(P0.01),肝SOD活性明顯下降(P0.01),NAFLD活動度積分(NAS)明顯升高(P0.01),肝CYP2E1表達量明顯增加(P0.01),肝臟病理切片顯示模型組肝小葉界限模糊,肝索排列紊亂,肝細胞明顯增大、呈腫脹態(tài),并可見大泡樣脂肪變性。與模型組比較,ARP可顯著降低血清TG、TC、LDL-C、FFA水平(P0.05或0.01),明顯升高HDL-C水平(P0.05),顯著降低血清ALT、AST含量(P0.01),明顯降低肝脂質TC、TG水平(P0.05或0.01),顯著升高SOD活性(P0.01),顯著降低MDA水平(P0.05或0.01),明顯降低NAFLD活動度積分(P0.05),改善NAFLD大鼠脂肪變性程度,明顯下調CYP2E1基因表達(P0.05)。結論:1.50%胎牛血清和8周高脂乳劑灌胃分別能成功誘發(fā)符合人類NAFLD病程的肝細胞LO2脂肪變性模型和非酒精性脂肪肝病大鼠模型。2.ARP能降低脂肪變性LO2細胞內的TG含量及NAFLD大鼠血清TG、TC、LDL-C,增加HDL-C,減少血清FFA含量,緩解血脂代謝紊亂,降低肝臟脂質TC、TG水平,降低NAS,改善肝臟脂質代謝及肝脂肪變。3.ARP能降低脂肪變性LO2細胞肝酶活性及NAFLD大鼠模型的血清肝酶活性,修復NAFLD病程內由脂質積聚而導致的肝損傷。4.ARP能下調NAFLD大鼠肝組織CYP2E1 m RNA表達,并能改善體內、體外氧化應激及脂質過氧化程度,其機制可能是通過減少肝細胞FFA的攝入,降低了肝內TG的合成,減輕了過量FFA的毒性作用及肝臟脂肪蓄積,從而改善線粒體β氧化,有效的清除ROS及自由基,保護肝線粒體,改善肝功能及肝臟脂肪變性,使肝細胞免受脂質過氧化及氧化應激的損傷,有效逆轉NAFLD。
【圖文】：

ARP 低劑組 ARP 中劑組 ARP 高劑組圖 3-4 肉眼觀察大鼠肝臟組織病變的情況Fig. 3-4 Observation of hepatic tissue pathology in rats3.3.5 光鏡下肝組織病理切片觀察正常組肝小葉結構完整，輪廓清晰可見，肝竇正常，肝索以中央靜脈為中心呈放射狀整齊排列，肝細胞胞質均勻，呈多邊形，無變性；模型組肝小葉結構不清，可見淋巴細胞和漿細胞的炎性浸潤，細胞核偏移，，肝竇數量減少，肝索排列紊亂，肝組織具有明顯水樣變性和脂肪變性，肝細胞內有明顯大小不等的脂滴空泡；辛伐他汀組及ARP各劑量組較模型組脂肪變性程度明顯減輕，炎癥反應減輕，脂肪空泡也都有所減少，部分細胞呈水樣變性，大部分肝細胞接近正常形態(tài)。

辛伐他汀組 ARP 低劑組ARP 中劑組 ARP 高劑組圖3-5 光鏡下觀察大鼠的肝組織病理病變（HE×100）Fig. 3-5 The fractographic of hepatic tissue pathology in rats
【學位授予單位】：廣東藥科大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

【參考文獻】

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本文編號：2709135