【摘要】：目的:通過觀察丁氏潰結(jié)口服方治療潰瘍性結(jié)腸炎模型小鼠的腸道炎癥的情況,評估丁氏潰結(jié)口服方的療效,并運用western-blot的手段證實其對UC的治療作用可能是通過下調(diào)IL-6、IL-17以及TNF-α的水平來實現(xiàn)的。材料與方法:1.檢索中科院上海有機化物研究所中藥與化學(xué)成分數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn)、中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(http://tcmspnw.com),收集丁氏潰結(jié)口服方中已被報道的化學(xué)成分。運用ADME/Tox虛擬計算系統(tǒng)篩選丁氏潰結(jié)口服方中的潛在活性成分。運用藥效團模型,虛擬預(yù)測丁氏潰結(jié)口服方中各活性成分的潛在作用靶點。將多個數(shù)據(jù)庫檢索結(jié)果予以整合,收集和UC發(fā)生、發(fā)展及治療相關(guān)的靶點。將丁氏潰結(jié)口服方的潛在作用靶點和UC的發(fā)生、發(fā)展及治療的靶點做PPI,構(gòu)建兩者間的相互作用網(wǎng)絡(luò),篩選出有顯著性意義的靶點,再從中篩選出丁氏潰結(jié)口服方治療UC的潛在作用靶點。2.將40只C57BL/6J小鼠,性別雌性,隨機分為空白組,模型組,美沙拉秦組,丁氏潰結(jié)口服方低劑量組以及丁氏潰結(jié)口服方高劑量組共5組,每組8只。除空白組外,其余幾組分別予3.5%DSS液體喂養(yǎng)7天復(fù)制UC小鼠急性期UC的模型。復(fù)制成功后,空白組予自由飲用礦泉水,其余組別分別予生理鹽水、美沙拉秦以及低劑量潰結(jié)口服方和高劑量潰結(jié)口服方灌胃治療14天。期間觀察小鼠的一般狀態(tài)。第14天結(jié)束后,處死全部小鼠,觀察腸黏膜形態(tài),評估結(jié)腸黏膜組織學(xué)評分。使用Western-Blot法測量小鼠結(jié)腸黏膜中的TNF-α、IL-6以及IL-17的含量,驗證丁氏潰結(jié)口服方在改善腸道炎癥方面的機制。結(jié)果:1.運用ADME/TOX虛擬計算系統(tǒng)共篩選175種潛在的活性成分。其中有13種沒有找到相應(yīng)的作用靶點,構(gòu)建出成分-靶點網(wǎng)絡(luò)。將丁氏潰結(jié)口服方的潛在作用靶點和已知的潰瘍性結(jié)腸炎的相關(guān)靶點分別做PPI,構(gòu)建相關(guān)聯(lián)系的網(wǎng)絡(luò)并進行網(wǎng)絡(luò)分析,結(jié)果顯示丁氏潰結(jié)口服方治療UC的潛在相應(yīng)靶點與IL-6、IL-17以及TNF-α蛋白及相關(guān)信號通路密切相關(guān)。2.UC模型復(fù)制成功后,小鼠精神不振、重量減輕、腹瀉伴有黏液膿血便。與空白組相比較,DAI評分增高(P0.05)。治療后,美沙拉秦組以及丁氏潰結(jié)口服方組小鼠炎癥好轉(zhuǎn),DAI評分比模型組低(P0.05)。丁氏潰結(jié)口服方低劑量組,治療情況較西藥組以及中藥高劑量組而言,相對較差,但優(yōu)于模型組。3.通過肉眼觀察,模型組小鼠結(jié)腸黏膜可見不同程度的損傷、水腫、充血及潰瘍糜爛形成,其評分高于空白組(P0.05)。丁氏潰結(jié)口服方組及西藥組小鼠組織破壞后有所恢復(fù),可見充血、水腫以及少許的糜爛,并未有典型的潰瘍形成。大體評分與模型組相比較低(P0.05)。4.鏡下觀察各組小鼠結(jié)腸黏膜,可見模型組小鼠結(jié)腸黏膜腺體結(jié)構(gòu)破壞明顯,排列稀疏,炎性細胞大量浸潤,充血水腫情況比較嚴(yán)重;丁氏潰結(jié)口服方組及美沙拉秦組黏膜未見明顯潰瘍,可見炎性細胞浸潤。5.相比空白組,模型組小鼠TNF-α、IL-6、IL-17表達水平均升高(P0.01),與模型組相比,美沙拉秦組和丁氏潰結(jié)口服方高劑量組能明顯減少TNF-α、IL-6表達水平(P0.01),丁氏潰結(jié)口服方低劑量組能減少TNF-α的表達水平(P0.05);和模型組相比,丁氏潰結(jié)口服方高劑量組在減少IL-17表達水平方面效果最好(P0.01),潰結(jié)口服方低劑量組和美沙拉秦組在減少IL-17表達水平方面具有很好的效果(P0.05)。結(jié)論:1.丁氏潰結(jié)口服方治療UC的作用機制可能是通過丁氏潰結(jié)口服方中的多藥效成分作用于各自相關(guān)靶點通過成分-靶點間的協(xié)同整合而最終起到降低血液中TNF-α、IL-6以及IL-17等細胞因子的作用從而起到治療UC的目的。2.丁氏潰結(jié)口服方對通過DSS復(fù)制的UC模型小鼠具有改善癥狀的效果,對小鼠便溏、黏液膿血便以及重量減輕的情況有所改善,從而達到減輕結(jié)腸組織的病變的效果,使小鼠一般情況以及黏膜情況、病理表現(xiàn)有較大的改善。3.經(jīng)DSS誘導(dǎo)的UC模型小鼠,丁氏潰結(jié)口服方可以從下調(diào)TNF-α、IL-6及IL-17的表達水平來減輕腸道的炎癥損傷。
【圖文】：

4 MOL000006 luteolin 36.16 0.25 MOL000098 quercetin 46.43 0.21.2 虛擬預(yù)測潰結(jié)口服方中的潛在的藥效分子靶標(biāo)，構(gòu)建“C-T”network運用藥效團模型，基于支持向量機（SVM）算法和隨機森林（RF）算法計算出各分跟其相對應(yīng)的靶點間的相互作用強度，以 SVM≥0.8，RF≥0.7 為作篩選條件，虛擬測丁氏潰結(jié)口服方中的各種活性成分的潛在作用靶點。在篩選的 175 種活性成分中有種成分沒有找到相應(yīng)的靶點；其余成分都通過有效方法預(yù)測出了各自的潛在作用靶盡管組方中藥各自具有不同的靶點，，但其中有很多靶點是多種組方中藥所共有的，這在一定程度上提示了丁氏潰結(jié)口服方中各中藥之間的協(xié)同整合效應(yīng)。進一步構(gòu)建成靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)，即“C-T” network，課題組及本人經(jīng)過初步篩選，結(jié)果如下圖“C-T” network（圖 2-1）。其中成分的 degrees 大于平均值，提示了組方中藥中大數(shù)成分可以通過“多靶點”的作用模式來實現(xiàn)復(fù)方整合作用的最終效應(yīng)。

Cytoscape 軟件的插件 Bisogenet，并選擇 InAct（www.ebi.ac.uk/inotein Reference Database（http://www.hprd.org/）、Molecular ine （http://mint.bio.uniroma2.it/mint/download.do）等 6 個 PPI結(jié)口服方的潛在作用靶點和已知的 UC 相關(guān)靶點分別做 PPI，構(gòu)建相互作用網(wǎng)絡(luò)中“degree”值大于平均值的節(jié)點定義為有顯著性意義的靶ytoscape 軟件的插件 CytoNAC，計算顯著性作用靶點相互作用網(wǎng)絡(luò)每entrality (DC)、Betweenness centrality (BC)、Closeness centralictor centrality (EC)、Network centrality (NC)、和 Local avertivity (LAC)六大拓撲參數(shù)，從而分析其在相互作用網(wǎng)絡(luò)中的拓撲重撲參數(shù)值大于2倍平均值的靶點作為丁氏潰結(jié)口服方治療UC的潛在IL-17 以及 TNF-α蛋白及相關(guān)信號通路密切相關(guān)（圖 2-2）。
【學(xué)位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：碩士
【學(xué)位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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