【摘要】：目的:通過觀察丁氏潰結口服方治療潰瘍性結腸炎模型小鼠的腸道炎癥的情況,評估丁氏潰結口服方的療效,并運用western-blot的手段證實其對UC的治療作用可能是通過下調IL-6、IL-17以及TNF-α的水平來實現(xiàn)的。材料與方法:1.檢索中科院上海有機化物研究所中藥與化學成分數(shù)據(jù)庫(http://www.organchem.csdb.cn)、中藥系統(tǒng)藥理學數(shù)據(jù)庫(http://tcmspnw.com),收集丁氏潰結口服方中已被報道的化學成分。運用ADME/Tox虛擬計算系統(tǒng)篩選丁氏潰結口服方中的潛在活性成分。運用藥效團模型,虛擬預測丁氏潰結口服方中各活性成分的潛在作用靶點。將多個數(shù)據(jù)庫檢索結果予以整合,收集和UC發(fā)生、發(fā)展及治療相關的靶點。將丁氏潰結口服方的潛在作用靶點和UC的發(fā)生、發(fā)展及治療的靶點做PPI,構建兩者間的相互作用網絡,篩選出有顯著性意義的靶點,再從中篩選出丁氏潰結口服方治療UC的潛在作用靶點。2.將40只C57BL/6J小鼠,性別雌性,隨機分為空白組,模型組,美沙拉秦組,丁氏潰結口服方低劑量組以及丁氏潰結口服方高劑量組共5組,每組8只。除空白組外,其余幾組分別予3.5%DSS液體喂養(yǎng)7天復制UC小鼠急性期UC的模型。復制成功后,空白組予自由飲用礦泉水,其余組別分別予生理鹽水、美沙拉秦以及低劑量潰結口服方和高劑量潰結口服方灌胃治療14天。期間觀察小鼠的一般狀態(tài)。第14天結束后,處死全部小鼠,觀察腸黏膜形態(tài),評估結腸黏膜組織學評分。使用Western-Blot法測量小鼠結腸黏膜中的TNF-α、IL-6以及IL-17的含量,驗證丁氏潰結口服方在改善腸道炎癥方面的機制。結果:1.運用ADME/TOX虛擬計算系統(tǒng)共篩選175種潛在的活性成分。其中有13種沒有找到相應的作用靶點,構建出成分-靶點網絡。將丁氏潰結口服方的潛在作用靶點和已知的潰瘍性結腸炎的相關靶點分別做PPI,構建相關聯(lián)系的網絡并進行網絡分析,結果顯示丁氏潰結口服方治療UC的潛在相應靶點與IL-6、IL-17以及TNF-α蛋白及相關信號通路密切相關。2.UC模型復制成功后,小鼠精神不振、重量減輕、腹瀉伴有黏液膿血便。與空白組相比較,DAI評分增高(P0.05)。治療后,美沙拉秦組以及丁氏潰結口服方組小鼠炎癥好轉,DAI評分比模型組低(P0.05)。丁氏潰結口服方低劑量組,治療情況較西藥組以及中藥高劑量組而言,相對較差,但優(yōu)于模型組。3.通過肉眼觀察,模型組小鼠結腸黏膜可見不同程度的損傷、水腫、充血及潰瘍糜爛形成,其評分高于空白組(P0.05)。丁氏潰結口服方組及西藥組小鼠組織破壞后有所恢復,可見充血、水腫以及少許的糜爛,并未有典型的潰瘍形成。大體評分與模型組相比較低(P0.05)。4.鏡下觀察各組小鼠結腸黏膜,可見模型組小鼠結腸黏膜腺體結構破壞明顯,排列稀疏,炎性細胞大量浸潤,充血水腫情況比較嚴重;丁氏潰結口服方組及美沙拉秦組黏膜未見明顯潰瘍,可見炎性細胞浸潤。5.相比空白組,模型組小鼠TNF-α、IL-6、IL-17表達水平均升高(P0.01),與模型組相比,美沙拉秦組和丁氏潰結口服方高劑量組能明顯減少TNF-α、IL-6表達水平(P0.01),丁氏潰結口服方低劑量組能減少TNF-α的表達水平(P0.05);和模型組相比,丁氏潰結口服方高劑量組在減少IL-17表達水平方面效果最好(P0.01),潰結口服方低劑量組和美沙拉秦組在減少IL-17表達水平方面具有很好的效果(P0.05)。結論:1.丁氏潰結口服方治療UC的作用機制可能是通過丁氏潰結口服方中的多藥效成分作用于各自相關靶點通過成分-靶點間的協(xié)同整合而最終起到降低血液中TNF-α、IL-6以及IL-17等細胞因子的作用從而起到治療UC的目的。2.丁氏潰結口服方對通過DSS復制的UC模型小鼠具有改善癥狀的效果,對小鼠便溏、黏液膿血便以及重量減輕的情況有所改善,從而達到減輕結腸組織的病變的效果,使小鼠一般情況以及黏膜情況、病理表現(xiàn)有較大的改善。3.經DSS誘導的UC模型小鼠,丁氏潰結口服方可以從下調TNF-α、IL-6及IL-17的表達水平來減輕腸道的炎癥損傷。
【圖文】：

4 MOL000006 luteolin 36.16 0.25 MOL000098 quercetin 46.43 0.21.2 虛擬預測潰結口服方中的潛在的藥效分子靶標，構建“C-T”network運用藥效團模型，基于支持向量機（SVM）算法和隨機森林（RF）算法計算出各分跟其相對應的靶點間的相互作用強度，以 SVM≥0.8，RF≥0.7 為作篩選條件，虛擬測丁氏潰結口服方中的各種活性成分的潛在作用靶點。在篩選的 175 種活性成分中有種成分沒有找到相應的靶點；其余成分都通過有效方法預測出了各自的潛在作用靶盡管組方中藥各自具有不同的靶點，，但其中有很多靶點是多種組方中藥所共有的，這在一定程度上提示了丁氏潰結口服方中各中藥之間的協(xié)同整合效應。進一步構建成靶點相互作用網絡，即“C-T” network，課題組及本人經過初步篩選，結果如下圖“C-T” network（圖 2-1）。其中成分的 degrees 大于平均值，提示了組方中藥中大數(shù)成分可以通過“多靶點”的作用模式來實現(xiàn)復方整合作用的最終效應。

Cytoscape 軟件的插件 Bisogenet，并選擇 InAct（www.ebi.ac.uk/inotein Reference Database（http://www.hprd.org/）、Molecular ine （http://mint.bio.uniroma2.it/mint/download.do）等 6 個 PPI結口服方的潛在作用靶點和已知的 UC 相關靶點分別做 PPI，構建相互作用網絡中“degree”值大于平均值的節(jié)點定義為有顯著性意義的靶ytoscape 軟件的插件 CytoNAC，計算顯著性作用靶點相互作用網絡每entrality (DC)、Betweenness centrality (BC)、Closeness centralictor centrality (EC)、Network centrality (NC)、和 Local avertivity (LAC)六大拓撲參數(shù)，從而分析其在相互作用網絡中的拓撲重撲參數(shù)值大于2倍平均值的靶點作為丁氏潰結口服方治療UC的潛在IL-17 以及 TNF-α蛋白及相關信號通路密切相關（圖 2-2）。
【學位授予單位】：遼寧中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2018
【分類號】：R285.5

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本文編號：2708451