【摘要】：阿爾茨海默病(Alzheimer'sdisease,AD)是一種多發(fā)于老年人的中樞神經系統(tǒng)退行性疾病,是癡呆最常見的病因,發(fā)病率呈快速增長趨勢。中國腦計劃已經將AD列為重要關注的三大神經和精神疾病之一。AD發(fā)病的危險因素多樣化,機制復雜化,尚不明確,為其治療帶來巨大困難。目前AD臨床治療藥物僅能減輕癥狀,不能延緩或終止病理進程,并且有較多的不良反應。因此,AD的新藥研發(fā)迫在眉睫。從天然產物中發(fā)現新藥具有巨大的潛力。目前研究顯示有多種芪類化合物具有潛在的抗AD作用。木豆素(cajaninstilbeneacid,CSA)是從木豆[Cajanusc cajan(L.)Millsp.]葉中提取的一種活性芪類化合物,具有神經保護等作用。因此推測CSA有可能成為治療AD的候選藥物。在新藥研發(fā)過程中,藥物代謝動力學研究可以對候選藥物的動力學特征進行早期評價,提高新藥研發(fā)成功率,降低成本和風險,獲得最有效的治療藥物。目前國內外沒有關于CSA改善學習記憶的研究報道,其藥物代謝動力學方面僅有兩篇文獻研究。因此,本研究擬采用不同的動物模型對CSA在學習記憶方面的藥理作用進行評價,然后從多個層面揭示其作用機制,最后在整體動物以及細胞水平探討其體內動力學過程和吸收轉運機制。完成的研究內容主要有以下三個方面:1.木豆素改善學習記憶障礙的藥理作用研究首先建立Aβ寡聚體所致小鼠學習記憶障礙的模型,然后采用建立的Aβ寡聚體腦內注射模型以及慢性睡眠剝奪模型,通過空場、物體位置識別、水迷宮和避暗行為學檢測方法評價CSA對模型動物學習記憶障礙的藥理作用。結果表明,海馬CA1區(qū)雙側注射Aβ1-42寡聚體(100pmol/只)可以成功建立學習記憶障礙模型;在Aβ寡聚體腦內注射模型和慢性睡眠剝奪模型中,灌胃給予CSA(7.5、15和30mg/kg)不影響模型小鼠的自主活動,可以改善模型小鼠對物體位置的短期辨別記憶能力,提高水迷宮實驗中的學習和記憶能力,增強模型小鼠在避暗實驗中獲得和保持被動回避能力。2.木豆素改善學習記憶障礙的作用機制研究首先建立測定小鼠血清和海馬組織中色氨酸(tryptophan,Trp)及其代謝產物(犬尿氨酸、犬尿喹啉酸、3-羥基犬尿氨酸、5-羥色胺和5-羥吲哚乙酸)、谷氨酸(glutamicacid,Glu)和γ-氨基丁酸(γ-aminobutyric acid,GABA)含量的液相色譜串聯質譜分析方法,然后從多個層面研究CSA改善Aβ寡聚體所致小鼠學習記憶障礙的機制,主要包括:采用尼氏染色和免疫熒光染色方法監(jiān)測神經元、星形膠質細胞和小膠質細胞的狀態(tài)以及海馬內Aβ的含量;采用建立的分析方法測定Trp及其代謝產物、Glu和GABA的含量;采用Western blot方法測定GluN1和GluN2B受體以及下游PKA/CREB/BDNF/TrkB信號通路的表達水平。結果表明,建立的分析方法具有良好的專屬性、線性、靈敏度和穩(wěn)定性,可用于比較不同實驗組動物體內各待測物含量的差異;CSA改善Aβ1-42寡聚體誘導的學習記憶障礙可能是通過清除海馬中Aβ,抑制星形膠質細胞和小膠質細胞的活化,維持Trp代謝的正常水平,逆轉Glu和GABA水平失調,抑制GluN2B過度表達和上調PKA/CREB/BDNF/TrkB信號通路等發(fā)揮作用。3.木豆素的藥物代謝動力學研究首先鑒定大鼠體內CSA的主要代謝產物并建立生物樣品分析方法,然后采用建立的分析方法研究CSA及其主要代謝產物在大鼠體內的藥代動力學特性和排泄途徑,最后基于Caco-2細胞模型研究CSA的腸道吸收轉運機制。結果表明,血漿、膽汁和尿液中主要存在五種CSA代謝產物(M1-M5),分別為CSA-3-O-glucuronide、CSA-2-COO-glucuronide、6,12-dihydroxy CSA、3-hydroxy-5-methoxystilbene-3-O-glucuronide和6-hydroxy CSA-3-O-glucuronide,說明葡萄糖醛酸化和氧化反應是其主要代謝途徑;建立的分析方法具有良好的專屬性、線性、靈敏度、精密度、準確度和穩(wěn)定性,可用于CSA的體內藥代動力學研究;CSA口服吸收迅速,生物利用度為44.36%,首過效應使CSA轉化成大量的CSA-3-O-glucuronide限制其吸收,CSA的肝腸循環(huán)、組織分布和腎臟重吸收等藥代動力學特性延緩其體內消除過程,延長作用時間;CSA及其代謝產物M1-M5以膽汁排泄為主,總排泄量約占給藥量的78%,CSA以原型形式從膽汁和尿液中排泄的總量約占給藥量的0.6%,而M1-M5的總排泄率為81%,說明CSA在體內被廣泛代謝,生成大量的代謝產物;CSA在Caco-2細胞模型中以跨細胞膜途徑的被動擴散方式進行轉運,吸收良好。綜上所述,CSA在不同動物模型中均表現出改善學習記憶障礙的藥理作用;其作用機制可能與清除海馬中Aβ,抑制膠質細胞活化,維持Trp代謝正常水平,逆轉Glu和GABA水平失調,抑制GluN2B過度表達和上調PKA/CREB/BDNF/TrkB信號通路等有關;CSA 口服時以被動擴散方式迅速吸收,緩慢消除,存在首過效應、肝腸循環(huán)、組織分布和腎臟重吸收等藥代動力學特性,主要代謝途徑為葡萄糖醛酸化和氧化反應,以膽汁排泄為主。本研究有助于了解CSA改善學習記憶障礙的藥理作用及其藥物代謝動力學規(guī)律,為其在治療AD方面的新藥研發(fā)奠定基礎,并為甚類化合物的開發(fā)利用提供參考。
【圖文】：

用棉簽沾少許３０％過氧化氫，擦拭顱骨表面，使骨縫完全暴露出來，，找到逡逑前囟并標記，調整頭顱在定位儀上的位置，使得前囟與后囟處在同一水平位置，顱逡逑骨正中線居中，且其兩側顱骨水平對稱。參照小鼠腦立體定位圖譜［１８７］（圖２－１），以逡逑前囟為原點，在坐標為側腦室ＡＰ：邋－０．２邋ｍｍ，ＭＬ：邋＋／±１．０ｍｍ；海馬ＡＰ：邋－２．０邋ｍｍ，逡逑ＭＬ：邋±１．５邋ｍｍ處用記號筆標示出，然后高速顱骨鉆孔，清除孔內骨屑，針頭戳破硬逡逑腦膜，用棉簽止血。將微量進樣器固定于腦立體定位儀的微量注射泵上，以硬腦膜逡逑為標準垂直進針２．５０１１１１（側腦室）／１．５＿（海馬），緩慢注射共２＾１１＾｜３１４２（５0＾１１＾，逡逑２７逡逑

３結果逡逑３．１邋ＡＰｌ－４２寡聚體的形態(tài)逡逑如圖２－３邋（Ａ）所示，Ａｐｕ４２經過體外配制形成寡聚體，呈球狀，高度為１－６邋ｒｎｎ，逡逑沒有纖維化聚集體。離心后得到的１００邋ＭＭＡｐＭ２寡聚體溶液４邋°Ｃ下放置８邋ｈ后再十倍逡逑稀釋，用原子力顯微鏡檢測，仍然只觀測到球狀寡聚體形態(tài)的ＡＰｍ２，未見纖維化聚逡逑集體。這表明實際手術過程中，同一天內所用的ＡＰｕ４２寡聚體溶液形態(tài)差別不大，都逡逑不含有纖維化聚集體。如圖２－３（Ｂ）所示，Ｗｅｓｔｅｒｎ邋ｂｌｏｔ實驗結果顯示按照本節(jié)“２．２．１”逡逑項下制備的ＡＰｍ２溶液中含有ＡＰ單體、三聚體、四聚體、六聚體和其他較大的寡聚逡逑體。因此，本實驗在體外成功配制出ＡｐＭ２寡聚體溶液，其中不包含纖維化聚集體，逡逑３１逡逑
【學位授予單位】：北京協和醫(yī)學院
【學位級別】：博士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5


本文編號：2708269