【摘要】：隨著人們生活方式改變、飲食結(jié)構(gòu)變化、生活節(jié)奏加快以及生存環(huán)境的惡化,神經(jīng)系相關(guān)的疾病,如疲勞、中風(fēng)、抑郁癥及免疫低下等發(fā)病率逐漸增加,嚴(yán)重影響了人們的身體健康及生存壽命。因此,亟待開發(fā)針對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的、具有有效低毒的藥用食品或佐劑。沙棘(Hippophae rhamnoides L.)是我國特色的傳統(tǒng)藥用食品,具有多種藥效學(xué)活性。西藏藥典 晶珠本草‖中具有提神醒腦、抗缺氧等調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)的相關(guān)作用。而多糖是沙棘中含量最多的特色成分,目前,關(guān)于沙棘多糖調(diào)節(jié)神經(jīng)系統(tǒng)作用及其機(jī)制,尚無系統(tǒng)的研究報道。本文從沙棘果實中分離獲得沙棘多糖,在細(xì)胞和動物水平上討沙棘多糖級分的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制述,以推動其在相關(guān)臨床醫(yī)藥領(lǐng)域的深入開發(fā)和應(yīng)用。首先,本文以沙棘果實為材料,按照青海省中科院實驗室建立的的方法進(jìn)行了分離:經(jīng)過水提、醇沉及DEAE-纖維素離子交換層析純化得到沙棘總糖HRWP。再將HRWP經(jīng)DEAE-纖維素離子交換柱分級,獲得HRWP-N及HRWP-A。HRWP-N為中性的HG型果膠,而HRWP-A為高甲基化的酸性HG型果膠級分。將HRWP、HRWP-N及HRWP-A給予小鼠給藥,探討其對于抗抑郁、抗腦腫瘤及抗中風(fēng)等神經(jīng)系統(tǒng)相關(guān)疾病,并比較分析其活性較好的活性單元。研究通過開場實驗OFT、游泳模型FST及慢性不可預(yù)見性模型CUMS模型探討沙棘多糖抗抑郁活性。首先采用FST模型分析,體內(nèi)口服給藥方式給藥小鼠沙棘總多糖HRWP(50,100和200 mg/kg),每天一次,共15天。結(jié)果顯示沙棘水溶性總多糖HRWP能夠減少小鼠的不動時間推測其具有抗抑郁樣的效果,并且該效果與神經(jīng)興奮性無關(guān);同時,沙棘多糖對于FST小鼠的體重?zé)o顯著影響,但對抑郁樣狀態(tài)導(dǎo)致的肝臟重量降低有一定恢復(fù)作用。然后使用FST再進(jìn)一步分析其抗抑郁作用較好的活性級分。對于沙棘多糖抗抑郁活性級分單元的分析顯示:HRWP-A能夠顯著提高FST小鼠的不動時間,其效果優(yōu)于HRWP-N及HRWP。進(jìn)一步,通過開場實驗OFT及慢性不可預(yù)見性模型CUMS探討HRWP-A對抑郁模型小鼠的恢復(fù)作用,并分析HRWP-A對CUMS小鼠神經(jīng)遞質(zhì)及氧化應(yīng)激分子等的影響。結(jié)果顯示HRWP-A可抑制CUMS誘導(dǎo)的自主活動降低等抑郁樣狀態(tài)。同時,HRWP一定程度上抑制了FST誘導(dǎo)的葡萄糖(GLU),超氧化物歧化酶(SOD)和谷胱甘肽過氧化物酶(GPx)的減少以及肌酸磷酸激酶(CK),乳酸脫氫酶(LDH),甘油三酯(TG)和丙二醛(MDA)的增加。ELISA結(jié)果顯示HRWP-A還上調(diào)CUMS小鼠腦神經(jīng)遞質(zhì)5羥色胺(5-HT)及多巴胺(DA)的水平。HRWP-A可上調(diào)CUMS小鼠海馬BDNF(brain derived neurotrophic factor)及pCREB(環(huán)磷腺苷效應(yīng)元件結(jié)合蛋白)。提示HRWP-A抗抑郁樣效果的機(jī)制涉及到抗氧化及維持腦內(nèi)神經(jīng)遞質(zhì)穩(wěn)態(tài)及上調(diào)BDNF-CREB通路。采用小鼠大腦中動脈閉塞(MCAO)誘導(dǎo)的局灶性腦缺血模型,探討HRWP-A對中風(fēng)的保護(hù)作用及其機(jī)制。小鼠接受HRWP-A(50,100和200 mg/kg)。持續(xù)14天,然后進(jìn)行右側(cè)大腦中動脈閉塞(MCAO)后再灌胃給予HRWP-A 2天。第三天安樂處死小鼠后,通過分析TTC實驗分析MCAO小鼠的腦梗塞面積;神經(jīng)學(xué)嚴(yán)重程度評分(mNSS),轉(zhuǎn)角測試和觸須引發(fā)的前肢放置測試mNSS行為學(xué)評分評估其行為學(xué);通過分析腦組織及血清中的氧化應(yīng)激分子及細(xì)胞因子分析HRWP-A發(fā)揮小鼠中風(fēng)保護(hù)作用的機(jī)制。結(jié)果顯示,HRWP-A顯著降低梗死面積并改善MCAO小鼠的神經(jīng)功能障礙。HRWP-A改善了神經(jīng)保護(hù)狀態(tài),因為它可以抑制MCAO小鼠MDA和NO的增加,同時減少腦中SOD,過氧化氫酶(CAT)和GPx水平的降低。同時,HRWP-A降低了血清中促炎指標(biāo)TNF-α,IL-1β和IL-6的水平。該過程伴隨著NLRP3及MMP9表達(dá)的下調(diào),同時上調(diào)claudin-5的表達(dá)。HRWP-A引起腦損傷的改善。HRWP-A的神經(jīng)保護(hù)性質(zhì)為其在藥用食品的開發(fā)及其用于潛在神經(jīng)保護(hù)的應(yīng)用提供了證據(jù)。通過體外研究判斷HRWP-A對Lewis肺癌,LLC;人膠質(zhì)瘤細(xì)胞細(xì)胞,U87;小鼠膠質(zhì)瘤細(xì)胞,GL261;人乳腺癌細(xì)胞,231等細(xì)胞無直接的增殖抑制作用。采用Lewis肺癌(LLC)荷瘤小鼠,對HRWP-A的抗腫瘤活性進(jìn)行預(yù)實驗,發(fā)現(xiàn)HRWP-A具有顯著抑制LLC-荷瘤小鼠的腫瘤生長的作用,其效果優(yōu)于總糖HRWP。然后,通過小鼠腦膠質(zhì)瘤(GL-261)原位模型進(jìn)行研究,結(jié)果表明HRWP-A可延長荷瘤小鼠的生存期。質(zhì)譜流式儀對其原位腫瘤微環(huán)境中免疫細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示:HRWP-A組對腫瘤原位微環(huán)境中的單核細(xì)胞數(shù)量較模型組顯著增加;而對的腫瘤局部的Treg、CD8+T、CD4+T及cDC的數(shù)量無顯著影響。單核細(xì)胞到達(dá)組織后分化為巨噬細(xì)胞,因而進(jìn)一步,探討了HRWP-A是否對小鼠巨噬細(xì)胞具有直接作用。分離小鼠腹腔巨噬細(xì)胞,qPCR及western blot分析結(jié)果顯示HRWP-A在體外上調(diào)巨噬細(xì)胞表面TLR4的表達(dá);該過程伴隨著MyD88表達(dá)和pIκB-α的明顯增加,而TLR4抗體預(yù)處理可在很大程度上消除這種效果。HRWP-A對巨噬細(xì)胞產(chǎn)生NO,IL-1β和IL-6的影響也被TLR4抗體及PDTC(NF-κB抑制劑)所抑制。此外,HRWP-A未能誘導(dǎo)C3H/HeJ(Tlr4基因突變)鼠來源腹腔巨噬細(xì)胞中NO,IL-1β和IL-6的產(chǎn)生,以上結(jié)果表明TLR4分子參與HRWP-A介導(dǎo)的巨噬細(xì)胞活化。這些結(jié)果對于理解藥用植物多糖對腦膠質(zhì)瘤生長抑制的免疫調(diào)節(jié)有重要意義。本研究對沙棘活性中心化合物進(jìn)行篩選后,探討沙棘多糖活性單元對神經(jīng)系統(tǒng)疾病的藥效活性,為多糖的構(gòu)效關(guān)系研究提供依據(jù),并為神經(jīng)系統(tǒng)疾病的新藥及輔助藥開發(fā)提供行業(yè)發(fā)展所需的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)支持;同時對沙棘多糖影響神經(jīng)系統(tǒng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行的研究,有助于理解神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)病機(jī)制及影響因素。
【學(xué)位授予單位】：吉林大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號】：R285

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本文編號：2704582