【摘要】：目的:本文應(yīng)用i TRAQ蛋白組學(xué)和轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù),從差異蛋白質(zhì)和差異基因?qū)用嫣接戯L(fēng)濕寧(以下簡稱FSN)膠囊治療類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎(RA)的作用機(jī)理,以期找到寒濕模型、CIA模型以及CIA+寒濕模型組(以下簡稱復(fù)合模型組)的相關(guān)差異蛋白和FSN膠囊作用后的差異基因,探討寒濕因素對CIA模型的影響,以及FSN膠囊對于RA治療的潛在作用,以期從病證結(jié)合角度研究FSN治療R A的作用機(jī)制。方法:(1)建立寒濕證模型、CIA模型和復(fù)合模型,用i TRAQ/TMT(同位素標(biāo)記相對和絕對定量)技術(shù)標(biāo)記結(jié)合液相串聯(lián)質(zhì)譜蛋白組學(xué)整合生物信息學(xué)技術(shù),鑒定寒濕、CIA、復(fù)合三模型大鼠血清的差異蛋白,對差異蛋白進(jìn)行基因本體論(G ene Ontology)、京都基因與基因組百科全書(Kyoto Encyclopedia Genes and Genomes)功能的注釋和富集分析,運用STRING蛋白相互作用數(shù)據(jù)庫得到顯著差異蛋白網(wǎng)絡(luò)互做關(guān)系,篩選找到寒濕證與CIA模型相關(guān)的差異蛋白。(2)SPF級SD大鼠隨機(jī)分為:正常組、CIA組、復(fù)合模型組、FSN低劑量組、FSN中劑量組、FSN高劑量組、Tofacitinib組、塞隆風(fēng)濕組,每組12只。正常組和模型組用等量的生理鹽水進(jìn)行灌胃,其中各劑量組FSN每日1次,Tofaciti nib、塞隆風(fēng)濕每日1次,均連續(xù)28天。造模28天后觀察各組大鼠一般情況、大鼠關(guān)節(jié)腫脹度、HE染色觀察大鼠關(guān)節(jié)病理學(xué)改變、酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)同步檢測大鼠外周血中RF、CRP以及IL-1β、IL-6、TNF-α等相關(guān)炎性細(xì)胞因子的水平,觀察FSN膠囊對不同模型大鼠的治療效果。(3)通過Illumina Hi Seq 4000平臺對正常組、CIA模型組、復(fù)合模型組、FSNCIA給藥組、FSN-復(fù)合給藥組的5個大鼠滑膜組織樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序分析,并對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析以及pathway通路分析,篩選找到FSN治療RA的關(guān)鍵差異表達(dá)基因。結(jié)果:(1)通過比較分析法應(yīng)用i TRAQ質(zhì)譜結(jié)合生物信息學(xué)技術(shù)確證組織中特征性的差異表達(dá)蛋白譜。對于樣本兩兩間的比較,本實驗以上調(diào)或下調(diào)1.3倍,即組間表達(dá)差異1.3(上調(diào))或0.77(下調(diào)),且P0.05為顯著差異標(biāo)準(zhǔn),篩選的蛋白作為差異表達(dá)蛋白。i TRAQ試劑標(biāo)記四組血清(正常對照組、CIA模型組、寒濕模型組、復(fù)合模型組)液質(zhì)聯(lián)用鑒定分析出435933個質(zhì)譜,肽段2230個,差異蛋白點540個,其中518個蛋白有定量值。寒濕模型組與對照組鑒定得到差異蛋白125個,寒濕組中上調(diào)86個,下調(diào)39個;CIA模型組與對照組差異蛋白93個,CIA組中上調(diào)27個,下調(diào)66個;復(fù)合模型組與對照組差異蛋白190個,復(fù)合組中上調(diào)152個,下調(diào)38個;復(fù)合模型組與寒濕模型組差異蛋白217個,上調(diào)140個,下調(diào)77個;復(fù)合組和CIA組差異蛋白245個,上調(diào)208個,下調(diào)37個。差異性表達(dá)蛋白的生物信息學(xué)方面,與RA發(fā)生相關(guān)的主要涉及炎癥反應(yīng)、免疫反應(yīng)、細(xì)胞結(jié)構(gòu)蛋白、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等方面的功能。所涉及的通路與RA相關(guān)的主要有補(bǔ)體系統(tǒng)、凝血系統(tǒng)的激活。寒濕因素對CIA模型血清蛋白影響關(guān)系較緊密的差異蛋白有HSP90AA1、ALDOA、PKM、RAC1、VWF、C2、HSP90B1、HSPD1、PSMA3、PSMA6、PSMA4、PSMA2等,在蛋白網(wǎng)絡(luò)互聯(lián)及相關(guān)通路中起關(guān)鍵作用,是RA發(fā)生的關(guān)鍵節(jié)點。(2)從大鼠的整體狀況上看:CIA模型組、復(fù)合模型組大鼠關(guān)節(jié)出現(xiàn)紅腫,飲水及攝食量降低,嗜睡,精神萎靡,皮毛枯燥無光澤,行動遲緩,大便稀溏。與正常組相比滑膜增生、形成血管翳、軟骨和骨組織受到浸潤亦伴發(fā)新生;關(guān)節(jié)紅腫、腫脹度顯著升高;類風(fēng)濕因子、C反應(yīng)蛋白水平以及與炎癥相關(guān)的炎性細(xì)胞因子水平明顯升高。與CIA模型組相比較,復(fù)合模型組滑膜增生及關(guān)節(jié)紅腫、腫脹度顯著升高;炎性細(xì)胞因子水平明顯升高;FSN膠囊藥物治療組與模型組相比精神狀況有好轉(zhuǎn),進(jìn)食量增加,行動力改善,大便稀溏狀況改善,關(guān)節(jié)紅腫減輕;FSN膠囊給藥組在28天后,各給藥組大鼠精神狀況有不同程度好轉(zhuǎn),飲水及攝食量增加,大鼠關(guān)節(jié)腫脹度明顯低于模型組,行動緩慢等癥狀明顯改觀;在關(guān)節(jié)病理方面,FSN藥物治療組可以減輕滑膜細(xì)胞增生,炎性細(xì)胞浸潤可見不同程度減少,關(guān)節(jié)病理特征得到改善,治療組大鼠外周血中RF、CRP以及炎性細(xì)胞因子IL-1β、IL-6、TNF-α的水平也明顯降低。(3)本研究采用Illumina Hi Seq 4000對FSN膠囊干預(yù)前后的CIA和復(fù)合模型的大鼠滑膜組織5個樣品進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測序,每個樣品平均產(chǎn)出4.48 Gb數(shù)據(jù),最終一共檢測出9070個新轉(zhuǎn)錄本,其中4084個屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型,2600個屬于新的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本,剩下的2386個屬于長鏈非編碼RNA。CIA模型給藥組與復(fù)合模型給藥組、正常組與復(fù)合模型給藥組、復(fù)合模型組與復(fù)合模型給藥組、CIA模型組與復(fù)合模型組、正常組與CIA模型給藥組、正常組與CIA模型組、正常組與復(fù)合模型組、CIA組與CIA模型給藥組差異表達(dá)基因分別是278個、118個、84個、65個、56個、37個、4個、3個。其中復(fù)合模型組與復(fù)合模型給藥組、CIA模型組與復(fù)合模型組和CIA組與CIA模型給藥組差異表達(dá)基因分別上調(diào)54個、1個、65個,以及下調(diào)30個、2個和0個。對差異表達(dá)基因進(jìn)行GO分析和pathway分析,GO富集分析表明,大部分差異表達(dá)的基因富集在細(xì)胞進(jìn)程、發(fā)育、代謝、免疫、生物進(jìn)程調(diào)節(jié)、刺激應(yīng)答、細(xì)胞信號、細(xì)胞組分、胞外區(qū)域、催化活性、結(jié)合活性等。Pathway通路分析結(jié)果表明,大部分差異表達(dá)的基因富集在細(xì)胞群落、運輸和分解代謝、蛋白折疊與降解脂代謝、免疫疾病等。FSN治療RA相關(guān)的基因有:FDFT1、SQLE、AKAP13、KCNMB1、UBB、RPS27A等。結(jié)論:(1)本研究首次懫用i TRAQ/TMT標(biāo)記結(jié)合液相串聯(lián)質(zhì)譜蛋白組學(xué)技術(shù)對三模型大鼠的差異表達(dá)蛋白進(jìn)行了初步鑒定,鑒定得到的差異表達(dá)蛋白可能在寒濕因素對CIA模型的影響中起了重要作用。(2)FSN膠囊可明顯改善類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎大鼠模型組的相關(guān)生理指標(biāo):IL-1β、IL-6、TNF-α、RF和CRP等。(3)本研究首次應(yīng)用轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)對FSN膠囊干預(yù)前后的大鼠滑膜組織的差異表達(dá)基因進(jìn)行鑒定,鑒定得到的差異表達(dá)基因可能是FSN膠囊治療RA的關(guān)鍵作用靶點。
【圖文】：

iTRAQ/TMT定量蛋白質(zhì)組學(xué)信息分析部分操作流程

圖 1-1 血清蛋白除高豐度前后的 SDS-PAGE 據(jù)的質(zhì)量控制定到肽段的長度分布長度分布情況進(jìn)行統(tǒng)計分析（如圖 1-3 所示段的比例，以橫坐標(biāo)代表肽段氨基酸殘基符合基于 trypsin 酶解和 HCD 碎裂方式的布符合質(zhì)控要求。
【學(xué)位授予單位】：成都中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2017
【分類號】：R285.5

【參考文獻(xiàn)】

相關(guān)期刊論文 前10條

1 管艷;蘇式兵;;慢性乙型肝炎證候差異基因表達(dá)譜分析[J];新中醫(yī);2014年09期

2 陳惠;辛麗麗;龔婕寧;;基于全轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)的轉(zhuǎn)錄組學(xué)在中醫(yī)藥領(lǐng)域的應(yīng)用前景分析[J];環(huán)球中醫(yī)藥;2013年10期

3 黃進(jìn);胡華斌;謝陽春;唐友紅;劉巍;鐘美佐;;TUBB3,TS,ERCC1mRNA表達(dá)對晚期胃癌化療療效和預(yù)后的影響[J];中南大學(xué)學(xué)報(醫(yī)學(xué)版);2013年06期

4 趙霞;岳慶喜;謝正蘭;李鐵;黃國堅;李井泉;王慧;;蛋白質(zhì)組學(xué)技術(shù)在中藥復(fù)雜體系研究中的應(yīng)用[J];生命科學(xué);2013年03期

5 殷惠軍;黃燁;;病證結(jié)合動物模型的研究進(jìn)展[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2013年01期

6 王階;虞桂;;microRNA與冠心病中醫(yī)證候研究[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2012年11期

7 劉喜德;洪旭濤;王云卿;王芳;蔡龍;馮瑩瑩;;溫化蠲痹方對膠原誘導(dǎo)性關(guān)節(jié)炎大鼠滑膜基因表達(dá)譜的影響[J];中國中西醫(yī)結(jié)合雜志;2012年10期

8 張爭;高志暉;魏建和;徐艷紅;李瀅;楊云;孟慧;隋春;汪孟曦;;三年生白木香機(jī)械傷害轉(zhuǎn)錄組學(xué)研究[J];藥學(xué)學(xué)報;2012年08期

9 鄭思道;吳紅金;劉宇娜;;microRNA在現(xiàn)代中醫(yī)藥研究中的作用和意義[J];中西醫(yī)結(jié)合心腦血管病雜志;2012年07期

10 蔣超;袁媛;劉貴明;黃璐琦;王緒敏;于軍;陳敏;;基于EST-SSR的金銀花分子鑒別方法研究[J];藥學(xué)學(xué)報;2012年06期

相關(guān)博士學(xué)位論文 前1條

1 李貴陽;兩株鰻弧菌全基因組序列測定及轉(zhuǎn)錄組比較分析[D];中國科學(xué)院研究生院（海洋研究所）;2011年

，

本文編號：2703896