【摘要】：肝纖維化(hepatic fibrosis,HF)是各種慢性肝病發(fā)展為肝硬化(hepatocirrhosis)甚至肝癌(hepatocarcinoma,HCC)所必須經(jīng)歷的共同病理過(guò)程,如何有效防治肝纖維化是困擾當(dāng)今醫(yī)學(xué)界的世界性難題。肝纖維化的發(fā)病實(shí)質(zhì)是細(xì)胞外基質(zhì)(extracellular matrix,ECM)的過(guò)度沉積,而活化型肝星狀細(xì)胞(hepatic stellate cell,HSC)是ECM最主要的細(xì)胞來(lái)源,因此靶向清除活化型HSC,進(jìn)而從源頭阻斷ECM過(guò)度沉積,被認(rèn)為是防治肝纖維化的主要策略。細(xì)胞衰老(cell senescence)是指在某些應(yīng)激條件下,細(xì)胞從正常分裂狀態(tài)不可逆轉(zhuǎn)地脫離細(xì)胞周期,進(jìn)入一種相對(duì)穩(wěn)定的增殖停滯狀態(tài)。細(xì)胞自噬(autophagy)主要由雙層膜結(jié)構(gòu)包裹衰老或受損的細(xì)胞器、蛋白質(zhì)、病原微生物等形成自噬溶酶體,然后利用溶酶體中的各種水解酶降解所包裹的內(nèi)容物,為細(xì)胞提供物質(zhì)與能量來(lái)源。細(xì)胞自噬與細(xì)胞衰老均是細(xì)胞應(yīng)對(duì)內(nèi)外環(huán)境改變的重要調(diào)節(jié)機(jī)制,并且兩者之間存在共同的信號(hào)通路。近年來(lái)的研究成果表明細(xì)胞自噬可以調(diào)控細(xì)胞衰老進(jìn)程,細(xì)胞自噬已經(jīng)成為當(dāng)前衰老與抗衰老研究的潛在突破點(diǎn)。如果使用適宜的藥物靶向調(diào)控HSC細(xì)胞自噬通路,進(jìn)而誘導(dǎo)HSC發(fā)生細(xì)胞衰老,將能夠阻斷HSC過(guò)度增殖,減少ECM沉積,緩解肝纖維化病理改變。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn),傳統(tǒng)中藥活性成分雙氫青蒿素(dihydroartemisinin,DHA)能夠顯著改善肝纖維化病理?yè)p傷,也能夠激活HSC細(xì)胞自噬通路�？紤]到細(xì)胞自噬、細(xì)胞衰老與肝纖維化的密切相關(guān),本論文創(chuàng)新性地提出科學(xué)假說(shuō):雙氫青蒿素可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞自噬與細(xì)胞衰老信號(hào)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗肝纖維化作用。本論文將重點(diǎn)圍繞這一科學(xué)假說(shuō)深入揭示雙氫青蒿素抗肝纖維化的潛在分子機(jī)制。本論文首先明確雙氫青蒿素在體內(nèi)外均能夠改善肝纖維化病理?yè)p傷。按照文獻(xiàn)報(bào)道建立經(jīng)典的四氯化碳(carbon tetrachloride,CC14)致大鼠肝纖維化模型,造模成功后腹腔注射不同劑量雙氫青蒿素治療4周。ELISA結(jié)果顯示雙氫青蒿素能夠顯著降低血清肝損傷指標(biāo)ALT、AST、ALT、LDH及TBIL水平,也能夠明顯下調(diào)血清肝纖維化指標(biāo)LN、HA、IV-C、PC-Ⅲ及HYP水平;肝組織病理學(xué)檢查顯示雙氫青蒿素能夠緩解肝臟纖維化病理改變,也能夠減輕膠原過(guò)度沉積;Western blot、real-time PCR及免疫熒光結(jié)果顯示雙氫青蒿素能夠顯著抑制肝組織纖維化指標(biāo)α-SMA、collagenl、fibronectin、TGF-βR1及PDGF-Rβ水平。從正常大鼠肝臟中分離靜息型HSC,使用PDGF-BB體外刺激HSC活化,然后加入不同劑量雙氫青蒿素進(jìn)行干預(yù)處理。結(jié)果顯示,雙氫青蒿素能夠劑量依賴性地下調(diào)HSC活化指標(biāo)α-SMA、collagen1、fibronectin、desmin、TGF-βR及PDGF-Rβ表達(dá)水平。綜合上述結(jié)果,雙氫青蒿素具有優(yōu)異的抗肝纖維化藥理活性,這為本論文后續(xù)的分子機(jī)制研究提供堅(jiān)實(shí)的藥效學(xué)基礎(chǔ)。本論文接下來(lái)明確雙氫青蒿素是否通過(guò)調(diào)控HSC細(xì)胞自噬與細(xì)胞衰老信號(hào)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗肝纖維化作用。按照上述方法建立大鼠肝纖維化模型,并采取治療給藥的方式給予雙氫青蒿素。與此同時(shí),從正常大鼠肝臟中分離靜息型HSC,使用PDGF-BB體外刺激HSC活化,然后加入不同劑量雙氫青蒿素進(jìn)行干預(yù)處理。結(jié)果顯示,雙氫青蒿素在體內(nèi)外均能夠誘導(dǎo)HSC發(fā)生細(xì)胞衰老,且這一作用與其上調(diào)GATA6的表達(dá)有關(guān)。沉默GATA6能夠削弱雙氫青蒿素誘導(dǎo)HSC發(fā)生細(xì)胞衰老,過(guò)表達(dá)GATA6能夠增強(qiáng)雙氫青蒿素誘導(dǎo)HSC發(fā)生細(xì)胞衰老。更有趣地,細(xì)胞自噬通路的激活可能是雙氫青蒿素誘導(dǎo)HSC細(xì)胞衰老與GATA6堆積的潛在機(jī)制,阻斷細(xì)胞自噬通路能夠削弱雙氫青蒿素誘導(dǎo)HSC細(xì)胞衰老及GATA6堆積的作用。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),雙氫青蒿素通過(guò)增強(qiáng)細(xì)胞自噬水平,降解自噬底物p62,促進(jìn)p62與GATA6的解離,導(dǎo)致GATA6堆積,進(jìn)而觸發(fā)細(xì)胞衰老的發(fā)生。細(xì)胞自噬通路特異性抑制劑3-MA、CQ、Bafilomycin A1或p62 plasmid均能夠阻斷p62的降解,進(jìn)而削弱雙氫青蒿素導(dǎo)致的HSC細(xì)胞衰老及GATA6堆積。綜合上述結(jié)果,雙氫青蒿素可能通過(guò)調(diào)控HSC細(xì)胞自噬與細(xì)胞衰老信號(hào)網(wǎng)絡(luò)發(fā)揮抗肝纖維化作用�，F(xiàn)已明確,衰老細(xì)胞典型特征表現(xiàn)為細(xì)胞周期的永久性停滯以及衰老相關(guān)分泌表型(senescence-associated secretory phenotype,SASP)。細(xì)胞衰老一方面可以阻斷受損細(xì)胞或癌細(xì)胞的增殖,另一方面可以通過(guò)SASP分泌各種炎癥相關(guān)因子影響周圍正常細(xì)胞功能。本論文緊接著明確雙氫青蒿素能否通過(guò)激活細(xì)胞自噬通路抑制HSC炎癥因子生成與釋放。體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)均按照上述操作進(jìn)行。結(jié)果顯示,雙氫青蒿素在體內(nèi)外均能夠抑制HSC炎癥因子的生成與釋放。有趣地,細(xì)胞自噬通路的激活可能與雙氫青蒿素的這一藥理效應(yīng)有關(guān)。阻斷細(xì)胞自噬通路能夠削弱雙氫青蒿素的抗炎效應(yīng),而上調(diào)細(xì)胞自噬通路能夠增強(qiáng)雙氫青蒿素的抗炎效應(yīng)。進(jìn)一步的分子機(jī)制研究發(fā)現(xiàn),雙氫青蒿素可能通過(guò)觸發(fā)HSC細(xì)胞內(nèi)ROS堆積,促進(jìn)JNK1/2活化,轉(zhuǎn)錄表達(dá)自噬相關(guān)基因,激活細(xì)胞自噬通路,進(jìn)而發(fā)揮抗炎效應(yīng)。ROS清除劑NAC、GSH、Na Py、Cat或JNK1/2特異性抑制劑SP600125、JNK1/2 siRNA均能夠削弱雙氫青蒿素導(dǎo)致的細(xì)胞自噬通路激活以及抗炎效應(yīng)。綜合上述結(jié)果,雙氫青蒿素可能通過(guò)激活細(xì)胞自噬通路抑制HSC炎癥因子生成與釋放。細(xì)胞發(fā)生衰老之后,雖然細(xì)胞周期處于停滯狀態(tài),但是仍然具有部分代謝活性,因此細(xì)胞衰老并不是細(xì)胞的最終命運(yùn)。新近研究發(fā)現(xiàn),衰老的細(xì)胞由于胞漿內(nèi)鐵離子水平顯著升高,對(duì)鐵死亡途徑(ferroptosis)具有高度敏感性,如果使用適宜的藥物調(diào)控鐵代謝通路,可以誘導(dǎo)細(xì)胞衰老向細(xì)胞鐵死亡的轉(zhuǎn)換。本論文最后明確雙氫青蒿素能否通過(guò)激活細(xì)胞自噬通路誘導(dǎo)HSC發(fā)生鐵死亡。按照上述方法進(jìn)行體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)。結(jié)果顯示,雙氫青蒿素在體內(nèi)外均能夠誘導(dǎo)HSC發(fā)生鐵死亡,且這一作用與其激活細(xì)胞自噬有關(guān)。阻斷細(xì)胞自噬能夠削弱雙氫青蒿素誘導(dǎo)HSC發(fā)生鐵死亡,促進(jìn)細(xì)胞自噬能夠加強(qiáng)雙氫青蒿素誘導(dǎo)HSC發(fā)生鐵死亡。有趣地,雙氫青蒿素可能通過(guò)上調(diào)NCOA4的表達(dá)水平,指引細(xì)胞自噬靶向識(shí)別并降解儲(chǔ)鐵蛋白FTH1,進(jìn)而增加鐵離子水平,導(dǎo)致鐵死亡的發(fā)生。沉默NCOA4能夠削弱雙氫青蒿素導(dǎo)致的HSC鐵死亡,但是過(guò)表達(dá)NCOA4能夠增強(qiáng)雙氫青蒿素導(dǎo)致HSC發(fā)生鐵死亡的作用。本論文的研究結(jié)果能夠在整體動(dòng)物與細(xì)胞分子水平揭示細(xì)胞自噬與細(xì)胞衰老信號(hào)網(wǎng)絡(luò)在肝纖維化病理進(jìn)程中的關(guān)鍵作用,進(jìn)一步闡明雙氫青蒿素抗肝纖維化的分子機(jī)制,為將雙氫青蒿素開(kāi)發(fā)為抗肝纖維化的臨床藥物提供可靠的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
【學(xué)位授予單位】：南京中醫(yī)藥大學(xué)
【學(xué)位級(jí)別】：博士
【學(xué)位授予年份】：2019
【分類號(hào)】：R285.5
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本文編號(hào)：2700689