發(fā)布時間：2020-06-06 18:47

【摘要】：目的通過體內(nèi)外實驗研究清達顆粒(Qingda granule,QDG)對血管緊張素Ⅱ(AngiotensinⅡ,AngⅡ)誘導(dǎo)血管平滑肌細胞(vascular smooth muscle cells,VSMCs)增殖和遷移的影響,并探討其作用的分子機制,以期為臨床上QDG治療高血壓、保護靶器官提供進一步的實驗依據(jù)。方法1.動物實驗:18只10周齡雄性C57BL/6小鼠隨機分為Control組:生理鹽水(埋泵)+生理鹽水(灌胃);AngⅡ組:AngⅡ(埋泵)+生理鹽水(灌胃);AngⅡ+QDG組:AngⅡ(埋泵)+QDG(灌胃)。采用鼠尾套管無創(chuàng)血壓儀監(jiān)測小鼠血壓,4周后進行取材,收集小鼠胸主動脈,免疫組化檢測胸主動脈增殖細胞核抗原(Proliferating Cell Nuclear Antigen,PCNA)的表達。2.細胞實驗:(1)VSMCs的分離及鑒定:采用組織貼塊法體外培養(yǎng)SD大鼠胸主動脈VSMCs,用免疫熒光染色對細胞進行鑒定,傳代后的3-6代用于實驗。(2)QDG及AngⅡ的濃度選擇:用不同濃度的QDG及AngⅡ干預(yù)VSMCs,采用MTT法檢測細胞活力。(3)QDG對AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs的生物學影響及分子機制:將VSMCs分為Control組、AngⅡ組、AngⅡ+QDG 0.125 mg/mL組、AngⅡ+QDG 0.25 mg/mL組、AngⅡ+QDG 0.5mg/mL組,共5組。通過倒置顯微鏡觀察和細胞計數(shù)評估VSMCs的生長情況;采用MTT法檢測細胞活力;采用劃痕實驗和Transwell實驗觀察細胞遷移;通過Western blot檢測PCNA及MAPK和PI3K/AKT通路中相關(guān)蛋白的表達。結(jié)果1.動物實驗:QDG干預(yù)4周后,對AngⅡ誘導(dǎo)高血壓模型小鼠的收縮壓、舒張壓及平均動脈壓均有顯著的改善作用。免疫組化結(jié)果顯示,QDG能抑制AngⅡ誘導(dǎo)高血壓模型小鼠胸主動脈PCNA表達的上調(diào)。2.細胞實驗:(1)培養(yǎng)3代的VSMCs經(jīng)倒置顯微鏡觀察及免疫熒光檢測顯示,純度95%以上,鑒定為VSMCs。(2)QDG在濃度為0~0.5 mg/mL范圍內(nèi),對大鼠胸主動脈VSMCs沒有細胞毒性,AngⅡ在濃度為0.01~1μM范圍內(nèi),對大鼠胸主動脈VSMCs均具有增殖作用。因此選用QDG(0.125、0.25、0.5 mg/mL)和AngⅡ(1μM)用于后續(xù)實驗。(3)倒置顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn),QDG干預(yù)后能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs生長,這個結(jié)果通過細胞計數(shù)得到了進一步證實。MTT檢測顯示,QDG干預(yù)后能顯著降低AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs活力增加。Western blot分析顯示,QDG干預(yù)后,能顯著下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)VSMCs PCNA的表達。(4)劃痕實驗及Transwell實驗結(jié)果顯示,QDG干預(yù)后能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)的VSMCs遷移。(5)Western blot檢測結(jié)果顯示,1μM的AngⅡ能上調(diào)VSMCs中p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-AKT的表達,并于5 min左右達到高峰,而對總的p38、JNK、ERK1/2、AKT無影響。QDG預(yù)處理12 h能顯著下調(diào)AngⅡ誘導(dǎo)的p-p38、p-JNK、p-ERK1/2、p-AKT的表達,對總的p38、JNK、ERK1/2、AKT無影響。結(jié)論QDG能顯著抑制AngⅡ誘導(dǎo)高血壓模型小鼠血壓的升高和胸主動脈VSMCs的增殖;QDG抑制VSMCs的增殖和遷移可能是通過抑制MAPK和PI3K/AKT通路的活化來實現(xiàn)的。我們的結(jié)果為QDG的臨床高血壓治療提供了進一步的實驗依據(jù)。
【學位授予單位】：福建中醫(yī)藥大學
【學位級別】：碩士
【學位授予年份】：2019
【分類號】：R285.5

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本文編號：2700105